Summary
Un système efficace de structure et de l'analyse fonctionnelle d'un gène dans une
Abstract
L'expression des gènes transgéniques dans les cellules eucaryotes est un puissant démarche de génétique inverse dans lequel un gène d'intérêt est exprimé sous le contrôle d'un système d'expression hétérologue pour faciliter l'analyse du phénotype résultant. Cette approche peut être utilisée pour exprimer un gène qui n'est pas normalement trouvé dans l'organisme, d'exprimer une forme mutante d'un produit du gène, ou de sur-expriment une forme dominante-négative du produit du gène. Il est particulièrement utile dans l'étude du système hématopoïétique, où la régulation transcriptionnelle est un mécanisme de contrôle majeur dans le développement et la différenciation des cellules B 1, a examiné en 2-4.
Génétique de la souris est un outil puissant pour l'étude des gènes humains et des maladies. Une analyse comparative de la souris et le génome humain révèle conservation de la synténie dans plus de 90% du génome 5. En outre, la plupart des technologies utilisées dans les modèles de souris est applicable à l'étude des gènes humains, par exemple, les perturbations des gènes et de remplacement allélique 6 . Toutefois, la création d'une souris transgénique nécessite beaucoup de ressources de nature à la fois financière et technique. Plusieurs projets ont commencé à compiler les bibliothèques d'assommer souches de souris (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) ou de la mutagenèse induite souches (RIKEN), qui nécessitent de vastes efforts et de collaboration 7. Par conséquent, il est souhaitable d'étudier d'abord le phénotype d'un gène désiré dans un modèle de culture cellulaire de cellules primaires avant de passer à un modèle de souris.
L'ADN rétroviral s'intègre dans l'ADN de l'hôte, de préférence au sein ou à proximité des unités de transcription ou îlots CpG, résultant en stable et héritable l'expression du gène d'intérêt emballé, tout en évitant le silencing transcriptionnel 8 9. Les gènes sont ensuite transcrits sous le contrôle d'un promoteur à haute efficacité antirétrovirale, résultant en un rendement élevé de la transcription et la production de protéines. Par conséquent, l'expression rétroviral peut être utilisé avec les cellules qui sont difficiles à transfecter, fourni les cellules sont dans un état actif lors de la mitose. Parce que les gènes de structure du virus sont contenus dans la lignée cellulaire d'emballage, les vecteurs d'expression utilisée pour cloner le gène d'intérêt ne contiennent pas de gènes de structure du virus, ce qui élimine la possibilité à la fois de révertants virale et augmente la sécurité de travailler avec des surnageants viraux car aucune virions infectieux sont produits 10.
Nous présentons ici un protocole pour la production recombinante rétroviraux et l'infection ultérieure des cellules B spléniques. Après isolement, les cellules cultivées rate sont stimulées par Th. lymphokines dérivées et anti-CD40, ce qui induit un éclatement de la prolifération cellulaire et la différenciation B 11. Ce protocole est idéal pour l'étude des événements survenus en fin de développement des cellules B et la différenciation, les cellules B sont isolées de la rate initiales suivantes évènements hématopoïétiques, mais avant la stimulation antigénique à induire la différenciation plasmocytaire.
Protocol
1. Splénique B-Lymphocyte isolement et de stimulation
- Récolter les rates de souris déficientes AID-12 entre 2-3 mois d'âge. L'isolement de la rate est effectué dans des conditions stériles et les organes sont temporairement conservés dans une solution saline de tampon phosphate froid (PBS) contenant 15% de sérum fœtal bovin (FBS).
- La rate est ensuite transférée à une hotte stérile et la culture de tissus homogénéisés dans 5 ml de PBS additionné de 2,5% de FBS. Transférer le broyat dans un tube de 15 ml faucon.
- Centrifuger l'échantillon de tissu homogénéisé la rate à 1000rpm pendant 10 minutes à 4 ° C pour culotter les cellules.
- Décanter le surnageant après centrifugation. Resuspendre la cellule dans 10 ml de cellules rouges du sang de pellets (RBC) du tampon de lyse à température ambiante pendant 7 minutes pour éviter toute contamination par les globules rouges.
- Centrifuger l'échantillon à 1000 rpm pendant 10 minutes et décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS contenant 2,5% de FBS.
- Retirer 100 aliquot uL et compter les cellules à une dilution de 1:1000 en utilisant un hématimètre standard en utilisant le bleu trypan pour exclure toutes les cellules mortes. Environ 20-30 millions de cellules peut être obtenue par rate.
- Centrifuger l'échantillon à 1000rpm pendant 10 minutes et décanter le surnageant.
- Reprendre le culot dans 0,5% de BSA / PBS contenant 2 mM d'EDTA à une concentration de 10 7 cellules par 90 pi.
- Ajouter anti-CD43 billes magnétiques recouvertes d'anticorps aux cellules de se lier spécifiquement les cellules non-B. Utiliser 10 perles ul par 90 pi (10 7 cellules). Bien mélanger et incuber à 4 ° C pendant 20 minutes.
- Une fois les cellules ont été étiquetés, lavez-les en ajoutant 2,5% de FBS / PBS en haut du tube. Centrifuger l'échantillon à 1000 rpm pendant 10 minutes.
- Décanter le surnageant. Resuspendre les cellules dans 0,1% de BSA / PBS à une concentration de 10x10 7 cellules par ml.
- Monter une colonne de tri magnétique sur un séparateur magnétique. Placer un tube conique directement sous la colonne pour recueillir les accréditives et charger la colonne avec 3 mL de 0,5% BSA / PBS au premier et au lavage.
- Une fois le liquide de lavage a traversé, le remplacer par un tube de collecte de nouvelles. Si l'échantillon est inférieur à 1 ml, ajuster le volume d'échantillon à 1 ml avec 0,5% BSA / PBS / EDTA et de charger l'échantillon dans la colonne. Chargez seulement 1 ml maximum de cellules par colonne et utiliser plusieurs colonnes si nécessaire.
- Laisser les cellules passivement circulation dans la colonne et de recueillir les cellules non liée dans le tube conique sous la colonne. Laver la colonne 4 fois avec 3 ml de 0,5% BSA / PBS tout en continuant à collecter les actions accréditives.
- Collecter toutes accréditives dans lequel CD43 négative des cellules B au repos sera enrichie. Jeter la colonne. Centrifugeuse accréditives à 1000 rpm pendant 10 minutes.
- Égoutter le surnageant et ajouter 10 ml de milieu (15% FCS / + glutamine, Pen / Strep, non-acides aminés essentiels, 50 uM Β-ME)
- Compter les cellules et la culture à 10 6 cellules par ml.
- Afin de stimuler la croissance des cellules B et la prolifération, de compléter le milieu avec des anticorps recombinants IL-4 et anti-CD40 de telle sorte que les concentrations finales sont de 20 pg / ml et 1 pg / mL, respectivement, et le transfert des cellules d'un flacon de culture.
- Culture des cellules pendant la nuit. Compter les cellules et diluer à 10 6 cellules par ml, ajouter l'IL-4 et CD40, le cas échéant.
- Cellules en culture pendant 72 heures avant l'infection virale.
2. La transfection des cellules productrices
Utiliser des protocoles établis pour la transfection en utilisant soit des lipides cationiques ou de phosphate de calcium. 10cm Transfecter 3 plaque par construction d'ADN, l'ADN en utilisant 100 ug de plasmide par plaque. Nous utilisons régulièrement la méthode de transfection de phosphate de calcium 13, 14 et note élevée titre viral lorsqu'ils sont complétés par la chloroquine.
- Utiliser 60% -70% de confluence des cellules Phoenix comme les cellules productrices d'être transfectées. A ce nombre de cellules confluent devrait être de 5 millions de cellules par plaque de 10 cm.
- Une heure avant la transfection, remplacez le support avec des produits frais média complète pour la croissance cellulaire Phoenix.
- Dans un tube stérile eppendorpf, mélanger 100 ug d'emballage construction d'ADN, 250 ul de 0,5 M CaCl 2, et ajuster le volume final à 500 ul d'eau stérile
- En utilisant une pipette de 1 mL, mélanger énergiquement cette solution avec 500 PNH 2X uL dans un tube en polypropylène de 15 ml
- Laisser ce mélange reposer à température ambiante pendant 8-10 minutes. Pendant ce temps, un précipité se forme.
- Ajouter le mélange de transfection goutte à goutte pour les cellules tout en remuant le moyen de répartir uniformément le mélange à travers.
- Incuber les cellules à 37 ° C pendant 12 heures.
- 12 heures post-transfection, de remplacer le milieu par le milieu B 8ml la croissance cellulaire et le retour complet aux cellules de l'incubateur à 37 ° C.
3. L'infection de cellules stimulées B spléniques
- Retirer le surnageant des cellules Phoenix 48h l'après-transfection et passer le surnageant à travers un filtre de 0,2 micron pour éliminer les débris cellulaires.
- Mélangez 3 mL de surnageant contenant le virus avec 3 mL de cellules B pré-activé (comme dans l'étape 1). Afin d'améliorer adsorption virale dans les cellules, ajouter polybrène à une concentration finale de 16 pg par ml.
- Infectent les cellules par centrifugation à 2500 rpm pendant 90 minutes à 30 ° C.
- Immédiatement après le spin, incuber pendant une autre de 48 à 72 heures à 37 ° C pour permettre la croissance et la prolifération cellulaire.
4. Cytométrie en flux
- L'utilisation d'un cytomètre en flux, analyser les cellules pour l'expression en surface d'IgG1 B220 et de surface. La présence d'IgG1 à la surface des cellules indique que la commutation isotypique est survenue à la suite de sauvetage réussi par la complémentation rétrovirale du gène de l'AID.
5. Les résultats représentatifs
Nous avons réussi à sauver la déficience de la déaminase protéine de facteur d'activation induite cytidine (AID) de l'AID-déficiente (AID-/ -) des lymphocytes B en utilisant transduction rétrovirale. En bref, nous avons généré des rétrovirus recombinants exprimant SECOURS souris (MAID) de protéines par transfection de cellules Phoenix avec PMX-MAID-GFP 15-18. Les virus récoltés ont été infectées en cellules B AID-déficient obtenu de l'AID des souris déficientes en ex vivo la commutation isotypique (CSR) des conditions de stimulation 19. Les cellules B infectées ont ensuite été analysés pour la RSE au IgG1 après 72hrs en culture en utilisant une analyse par cytométrie de flux. La figure 2 montre la détection d'IgG1 à la surface des cellules B avec l'aide, mais pas la construction de vide, indiquant que la RSE est survenue à la suite du sauvetage d'expression de l'AID.
Figure 1: Schéma d'encapsidation rétrovirale dans des cellules producteur: gène d'intérêt, représenté par Ψ, a été sous-cloné dans PMX-IRES-GFP, comme décrit précédemment 15. Le plasmide a été transfecté dans une ligne d'emballage écotrope virale cellulaire capable de produire gag-pol et protéine d'enveloppe (Phoenix, Orbigen), en utilisant la méthode du phosphate de calcium 13, 14. Quarante-huit heures après la transfection, le surnageant contenant les particules virales ont été récoltés pour l'infection dans les cellules cibles B primaires provenant de souris.
Figure 2: les cellules B SECOURS déficiente, stimulées par l'anti-CD40 et IL-4 ont été infectés par un rétrovirus contenant PMX-MAID-GFP ou un rétrovirus exprimant GFP seule. Le niveau de la RSE pour IgG1 a été évaluée par analyse FACS.
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Discussion
Transduction rétrovirale de cellules B spléniques comme décrit ici et comme le montre la figure 1 est une approche génétique qui est utile dans l'étude des lymphocytes B en raison de nombreux événements de développement dans lymphopoesis sont contrôlés par la régulation transcriptionnelle 1, 2. Dans les derniers stades de la maturation des cellules B, déclenchant via CD40L est essentiel pour l'induction de la croissance des cellules B, l'entrée dans le cycle cellulaire et la prolifération 11, 20. Comme le montre la figure 2, les cellules B peuvent être stimulées in vitro avec des anti-CD40 et IL4 à subir cette explosion de prolifération, et les vecteurs rétroviraux sont des outils utiles pour sur-exprimer les protéines qui peut fonctionner durant ces stades de développement des cellules B. Dans l'exemple montré dans la Fig. 2, nous démontrer que l'aide des cellules déficientes en B qui sont incapables de se soumettre à la RSE (ici pour IgG1) peut être sauvé pour cette fonction par un retrovirus l'introduction du gène SECOURS souris. Cette approche nous permet de suivre la GFP de cellules positives (voir figure 1) qui ont subi la RSE (IgG1 GFP + +).
Cette méthode est avantageuse par rapport à la modélisation de la souris en ce sens qu'il peut être complété en moins d'une semaine après la récolte spléniques par opposition à l'investissement de temps pour créer une souris transgénique. Le type d'analyse peut être adapté aux applications de l'enquêteur, ici nous avons présenté l'analyse de la commutation isotypique par cytométrie en flux comme dans la Figure 2. En outre, cette méthode est appropriée pour une gamme d'approches biochimiques après l'extraction de protéines à partir des cellules transduites rétrovirale 15, 21.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
CK est soutenu par Columbia University Graduate programme. UB est Fellow de la Société de leucémie et lymphome d'Amérique, le destinataire de bourse de nouveau chercheur de la Fondation recherche sur la leucémie et est soutenu par l'Université de Columbia New Faculté des fonds de démarrage.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
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