Summary
מערכת יעילה של מבנה וניתוח פונקציה של גן ב
Abstract
הביטוי מהונדס של גנים בתאים אוקריוטים היא גישה חזקה גנטית הפוכה שבה הגן של עניין מתבטא בשליטה של מערכת ביטוי Heterologous כדי להקל על ניתוח של פנוטיפ שהתקבל. גישה זו ניתן להשתמש כדי לבטא את הגן כי לא נמצא בדרך כלל האורגניזם, להביע את טופס מוטציה של מוצר הגן, או יתר להביע בצורה דומיננטית שלילית של המוצר גן. זה שימושי במיוחד במחקר של מערכת hematopoetic, שבה תקנה תעתיק הוא מנגנון בקרה מרכזי בהתפתחות והתמיינות של תאים B 1, הנסקרת ב 2-4.
עכבר הגנטיקה הוא כלי רב עוצמה ללימוד גנים מחלות אנושיות. ניתוח השוואתי של העכבר הגנום האנושי מגלה שימור synteny של מעל 90% של הגנום 5. כמו כן, רוב הטכנולוגיה שבה נעשה שימוש במודלים של העכבר הוא ישים בחקר הגנים האנושיים, למשל, שיבושים גנים החלפת allelic 6 . עם זאת, יצירה של עכבר מהונדס דורש מידה רבה של משאבי הטבע הן כספי וטכני. מספר פרויקטים כבר החלו לאסוף ספריות של לדפוק את זני העכבר (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) או mutagenesis זנים המושרה (RIKEN), אשר דורשים בקנה מידה גדול מאמצים ושיתוף פעולה 7. לכן, רצוי קודם ללמוד את הפנוטיפ של הגן הרצוי במודל התא התרבות של תאים ראשוניים לפני שממשיך במודל של עכברים.
ה-DNA retroviral משתלב ה-DNA המארח, רצוי בתוך או ליד יחידות שעתוק או איים CPG, והתוצאה היא יציבה תורשתי הביטוי של הגן ארוז עניין תוך הימנעות השתקה תעתיק 8 9. הגנים מתועתקים אז בשליטת מקדם יעילות גבוהה retroviral, וכתוצאה מכך יעילות גבוהה של שעתוק וייצור חלבונים. לכן, הביטוי retroviral ניתן להשתמש בתאים שקשה transfect, ובלבד התאים נמצאים במצב פעיל במהלך מיטוזה. מכיוון גנים מבניים של הנגיף נמצאים בתוך הקו תא אריזה, וקטורים ביטוי בשימוש לשבט את הגן של עניין אינם מכילים גנים מבניים של הנגיף, אשר שניהם מבטלת את האפשרות של revertants ויראלי מגביר את בטיחות של עבודה עם supernatants ויראלי כמו virions לא זיהומיות מיוצרים 10.
כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור רקומביננטי retroviral זיהום הבאות של תאים B הטחול. לאחר הבידוד, התאים בתרבית הם הטחול מגורה עם lymphokines נגזר ה 'אנטי CD40, אשר מעוררת פרץ של התפשטות תאים B ו בידול 11. פרוטוקול זה הוא אידיאלי ללימוד אירועים המתרחשים מאוחר בהתפתחות התא B ו בידול, כמו תאים B מבודדים הטחול בעקבות האירועים hematopoetic הראשונית אבל לפני גירוי antigenic להשרות התמיינות plasmacytic.
Protocol
1. בידוד הטחול B-לימפוציטים וגירוי
- קציר spleens מתרומת זרע מחסר עכברים 12 בין 2-3 חודשים של גיל. הבידוד של הטחול מבוצעת בתנאים סטריליים האיברים נשמרים באופן זמני מלוחים למאגר קר פוספט (PBS) המכילה 15% נסיוב עוברי שור (FBS).
- הטחול הוא הועבר לאחר מכן ברדס רקמה סטרילית תרבות הומוגני ב 5 מ"ל של PBS FBS בתוספת 2.5%. מעבירים את homogenate אל צינור בז 15 מ"ל.
- צנטריפוגה מדגם הומוגני רקמת הטחול ב 1000rpm במשך 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים.
- למזוג supernatant לאחר צנטריפוגה. Resuspend התא גלולה בתא 10 מ"ל דם אדומים (RBC) חיץ תמוגה בטמפרטורת החדר למשך 7 דקות, כדי למנוע זיהום על ידי כדוריות דם אדומות.
- צנטריפוגה מדגם בסל"ד 1000 למשך 10 דקות ו supernatant למזוג ו resuspend התאים המכיל 10 מ"ל PBS 2.5% FBS.
- הסר 100 aliquot μL ולספור את התאים בדילול 1:1000 באמצעות hemacytometer תקן באמצעות trypan כחול להוציא את כל התאים המתים. כ 2-30 תאים ניתן להשיג בכל הטחול.
- צנטריפוגה מדגם ב 1000rpm במשך 10 דקות למזוג supernatant.
- Resuspend גלולה ב -0.5% BSA / PBS המכיל 2mm EDTA בריכוז של 10 7 תאים לכל μL 90.
- הוסף אנטי CD43 מצופה נוגדנים חרוזים מגנטיים על התאים במיוחד כדי לאגד הלא B תאים. השתמש 10 חרוזים μL לכל μL 90 (10 7 תאים). מערבבים היטב דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות.
- ברגע שתאי סומנו בתווית, לשטוף אותם על ידי הוספת 2.5% FBS / PBS על גבי הצינור. צנטריפוגה מדגם בסל"ד 1000 למשך 10 דקות.
- למזוג supernatant. Resuspend התאים 0.1% BSA / PBS בריכוז של 10x10 7 תאים לכל מיליליטר.
- הר טור מיון מגנטי על מפריד מגנטי. מיקום צינור חרוטי ישירות מתחת בעמודה לאסוף את הזרימה דרך לטעון את הטור עם 0.5% 3mL BSA / PBS על הממשלה ולשטוף.
- לאחר נוזלים יש לשטוף זרמו, להחליף עם צינור אוסף חדש. אם המדגם הוא פחות מ 1 מ"ל, להתאים את עוצמת הקול מדגם מ"ל 1 עם 0.5% BSA / PBS / EDTA עומס המדגם בעמודה. טען רק 1 מ"ל המרבי של תאים לכל עמודה ולהשתמש עמודות מרובות במידת הצורך.
- אפשר התאים פסיבי לזרום דרך העמודה לאסוף את התאים מאוגד בצינור חרוטי תחת העמודה. לשטוף את העמודה 4 פעמים עם 3 מ"ל 0.5% BSA / PBS תוך כדי לאסוף את הזרימה דרך.
- לאסוף את כל זרימה דרך שבה CD43 בתאי B שלילי מנוחה יהיה מועשר. מחק את העמודה. צנטריפוגה זרימה דרך בסל"ד 1000 למשך 10 דקות.
- מסננים את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל בינוני (15% FCS / + גלוטמין, פן / סטרפטוקוקוס, שאינם חיוניים חומצות אמינו, 50 מיקרומטר Β-ME)
- ספירת התאים והתרבות 10 6 תאים לכל מיליליטר.
- כדי להמריץ את הצמיחה התפשטות תאים B ו, במוסף בינוני עם נוגדן רקומביננטי IL-4 ו אנטי CD40 כזה הריכוזים הסופיים 20 מיקרוגרם / מ"ל ו - 1 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה, ולהעביר את התאים בקבוק תרבות.
- התרבות התאים לילה. ספירת תאים ו לדלל עד 10 6 תאים לכל מיליליטר, והוסיף IL-4 ו CD40 על פי הצורך.
- התרבות התאים למשך 72 שעות לפני זיהום ויראלי.
2. Transfection של תאים מפיק
שימוש בפרוטוקולים הוקמה עבור transfection או באמצעות קטיוני שומנים או סידן פוספט. Transfect 3 צלחת 10 ס"מ לכל לבנות DNA, באמצעות 100 מיקרוגרם פלסמיד דנ"א לכל צלחת. אנו משתמשים באופן שגרתי סידן פוספט transfection שיטה 13, 14 ו - לב titer ויראלי גבוה, כאשר בתוספת chloroquine.
- השתמש ב 60% -70% תאים ומחוברות פיניקס כמו תאים המפיק להיות transfected. בספירה זו צריך להיות מפגש תא 5,000,000 תאים לכל צלחת 10 ס"מ.
- שעה אחת לפני transfection, להחליף את התקשורת עם התקשורת להשלים טרי צמיחת תאים פיניקס.
- בתוך צינור eppendorpf סטרילי, לשלב 100 מיקרוגרם של אריזות לבנות DNA, 250 μL של CaCl 2 0.5m, ולהתאים את עוצמת הקול הסופי μL 500 עם מים סטריליים
- בעזרת פיפטה 1 מ"ל, במרץ לערבב את הפתרון הזה עם HNP 500 2X μL בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל
- תערובת זו אפשר לנוח בטמפרטורת החדר למשך 80-10 דקות. במהלך תקופה זו משקע יהוו.
- מוסיפים את תערובת transfection ירידה מבחינת אל התאים בעוד מתערבל המדיום כדי לפזר באופן שווה את התערובת לאורך.
- דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות.
- 12 שעות לאחר transfection, להחליף את תא בינוני עם 8ml להשלים בינוני B הצמיחה ולהחזיר את התאים ל 37 ° C חממה.
3. זיהום של מגורה תאים B הטחול
- הסר supernatant מתאי פיניקס 48hr שלאחר transfection ולהעביר את supernatant דרך 0.2 מיקרון המסנן כדי להסיר כל פסולת התא.
- מערבבים 3 מ"ל של נגיף המכיל supernatant עם 3 מ"ל של טרום הפעלת תאים B (כמו שלב 1). כדי לשפר את ספיחה נגיפי אל התאים, להוסיף polybrene בריכוז סופי של 16 מיקרוגרם לכל מ"ל.
- להדביק את התאים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 2500 למשך 90 דקות בקצב של 30 ° C.
- מיד לאחר הסחיטה, דגירה למשך 48-72 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר גדילת התא התפוצה.
4. Cytometry זרימה ניתוח
- שימוש cytometer זרימה, לנתח את התאים לביטוי פני השטח של IgG1 B220 ו - פני השטח. הנוכחות של IgG1 על פני השטח של התאים עולה כי הבורר רקומבינציה בכיתה אירעה כתוצאה חילוץ מוצלח באמצעות השלמה retroviral של הגן AID.
5. נציג תוצאות
יש לנו להציל בהצלחה מחסור של חלבון גורם דאמינז הפעלה Cytidine מושרה (AID) מתרומת זרע מחסר (AID-/ -) לימפוציטים-B באמצעות התמרה retroviral. בקצרה, אנחנו שנוצר רטרווירוסים רקומביננטי להביע AID העכבר (המשרתת) חלבון ידי transfecting תאים פיניקס עם PMX-GFP משרתת 15-18. וירוסים שנקטפו היו נגועים לתוך AID מחסר בתאי B המתקבל AID מחסר עכברים רקומבינציה לשעבר vivo בכיתה מתג (CSR) התנאים גירוי 19. התאים הנגועים ב נותחו לאחר מכן עבור אל CSR IgG1 לאחר 72hrs בתרבות באמצעות ניתוח תזרים cytometry. איור 2 מציג את הזיהוי של IgG1 על פני השטח של תאים B עם תרומת זרע, אך לא לבנות ריק, המציין כי CSR אירעה כתוצאה הצלה ביטוי AID.
איור 1: תוכנית של אריזות retroviral בתוך התאים מפיק: Gene של עניין, המיוצגים על ידי Ψ, היה subcloned לתוך PMX-IRES-GFP, כפי שתואר לעיל 15. הפלסמיד היה transfected לתוך קו אריזה ecotropic ויראלי תא מסוגל לייצר איסור הפרסום-pol וחלבון המעטפה (פניקס, Orbigen), באמצעות שיטת סידן פוספט 13, 14. ארבעים ושמונה שעות לאחר transfection, supernatant חלקיקים נגיפיים המכיל נאסף על זיהום לתוך היעד העיקרי בתאי B שהתקבלו בעכברים.
איור 2: חסר AID תאים B, מגורה עם אנטי CD40 ו - IL-4 נדבקו רטרווירוס המכיל PMX-GFP משרתת או רטרווירוס להביע GFP לבד. רמת אחריות חברתית כדי IgG1 הוערך על ידי ניתוח FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
התמרה retroviral של תאים B הטחול כפי שתואר כאן, כמתואר באיור 1 היא גישה גנטית שימושי במחקר של לימפוציטים-B כי רבים מן האירועים התפתחותיים lymphopoesis נשלטים על ידי תקנה תעתיק 1, 2. בשלבים מאוחרים יותר של ההתבגרות תא B, מפעילה באמצעות CD40L חיוני לזירוז הצמיחה תא B, הכניסה מחזור התא, ושגשוגם 11, 20. כפי שניתן לראות בתרשים 2, תאים B יכול להיות מגורה במבחנה עם אנטי CD40 ו IL4 לעבור את זה פרץ של התפשטות, וקטורים retroviral הם כלי שימושי יותר מ-לבטא חלבונים אלה יפעלו במהלך שלבי התפתחות תא B. בדוגמה המוצגת באיור. 2, אנו מראים כי AID מחסר תאי B אינם יכולים לעבור CSR (כאן IgG1) ניתן להציל עבור פונקציה זו על ידי retrovirally להחדיר את הגן AID העכבר. גישה זו מאפשרת לנו לעקוב אחר עבור ה-GFP חיובי תאים (ראה תרשים 1) אשר עברו CSR (GFP IgG1 + +).
בשיטה זו יש יתרון על דוגמנות העכבר כי זה יכול להסתיים בשבוע פחות לאחר הקציר הטחול לעומת ההשקעה הזמן ליצור עכבר מהונדס. סוג של ניתוח יכול להיות מותאם ליישומים של החוקר; כאן הצגנו ניתוח של רקומבינציה לעבור בכיתה על ידי cytometry זרימה כמו באיור 2. בנוסף, שיטה זו מתאימה למגוון רחב של גישות ביוכימיות הבאים מיצוי חלבון מתאי retrovirally-transduced 15, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
CK נתמכת על ידי תוכנית קולומביה בוגרת אוניברסיטת. UB הוא בחור של לוקמיה לימפומה וחברה של אמריקה, זכה בפרס החוקר חדש מהקרן לחקר לוקמיה והוא נתמך על ידי הפקולטה באוניברסיטת קולומביה בניו הזנק וקרנות.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. Introduction to Genetic Analysis. , W. H. Freeman. New York. (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
