Summary
에서 유전자의 구조와 기능 분석의 효율적인 시스템
Abstract
진핵 세포에있는 유전자의 형질 표현 관심의 유전자가 결과의 표현형 분석을 용이하게하기 위해 heterologous 표현 시스템의 제어하에 표현되는 강력한 반대 유전자 접근 방식이다. 이 접근 방법은 일반적으로 유기체에서 발견되지 않은 유전자를 표현하는 유전자 제품의 돌연변이 형태를 표현하기 위해, 또는 유전자 제품의 지배 - 부정적인 양식을 통해 - 표현하는 데 사용될 수 있습니다. 그것은 transcriptional 규정이 2-4 검토 B 세포 1의 개발과 차별화의 주요 제어 메커니즘입니다 hematopoetic 시스템의 연구에서 특히 유용합니다.
마우스 유전학은 인간의 유전자와 질병의 연구를위한 강력한 도구입니다. 마우스와 인간 게놈의 비교 분석은 게놈 5 90 % 이상의 synteny의 절약을 보여준다. 또한, 많은 마우스 모델에 사용되는 기술의 예를 들어, 유전자 중단 및 allelic 교체 6 인간의 유전자 연구에 적용 . 그러나, 유전자 변형 마우스의 생성은 재정 및 기술 자연 모두 자원의 큰 거래를 필요로합니다. 몇몇 프로젝트는 마우스 변종을 노크의 라이브러리 (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) 또는 대규모 노력과 협업 7 필요한 돌연변이 유발 유도 변종 (RIKEN)를 컴파일하기 시작했다. 따라서, 먼저 마우스 모델에 진행하기 전에 기본 세포의 세포 배양 모델에 원하는 유전자의 표현형 연구를하는 것이 바람직하다.
Retroviral DNA는 안정의 결과, 선호 내에서 또는 전사 단위 또는 CPG 섬으로 근처 호스트 DNA에 통합하여 transcriptional 입을 8 9을 회피하면서 관심의 포장 유전자의 표현을 물려 전할 수있는. 유전자는 다음 전사 및 단백질 생산의 높은 효율성의 결과, 높은 효율 retroviral 발기인의 통제하에 베꼈는데 있습니다. 따라서, retroviral 표현은 transfect하기 어려운 세포와 함께 사용 유사 분열 동안 활성 상태에있는 세포를 제공할 수 있습니다. 바이러스의 구조 유전자가 패키징 세포주에 포함된 있기 때문에, 관심있는 유전자를 복제하는 데 사용되는 표현 벡터는 모두 바이러스 revertants의 가능성을 제거하고 바이러스 supernatants 작업의 안전을 증가하는, 바이러스에 대한 구조 유전자를 포함하지 더 전염성 virions는 10을 생산하지 않습니다로.
여기 재조합 retroviral 생산과 지라 B 세포의 후속 감염에 대한 프로토콜을 제시한다. 분리 후, 교양 지라 세포 목 파생 lymphokines 및 B 세포의 증식과 분화 11 파열을 유도 방지 CD40과 자극하고 있습니다. 이 프로토콜은 B 세포가 plasmacytic 분화를 유도하는 것을 원칙으로하지만 이전 antigenic의 자극에 초기 hematopoetic 이벤트 다음과 비장으로부터 격리되면서, 늦은 B 세포 개발과 차별에서 발생 사건의 연구에 이상적입니다.
Protocol
1. 지라 B - 림프구 분리 및 자극
- AID - 결함 쥐들이 12 세 2~3개월 사이 spleens를 수확. 비장의 분리는 무균 상태에서 수행되고 장기가 일시적으로 15% 태아 소 혈청 (FBS)이있는 차가운 인산 버퍼 호수 (PBS)에 보관됩니다.
- 비장은 다음 멸균 조직 문화 후드로 전송하고 2.5 % FBS와 보충 PBS 5 ML에 균질입니다. 15 ML 팔콘 튜브에 homogenate를 전송합니다.
- 4 10 분 동안 1000rpm에서 균질 지라 조직 샘플을 원심 분리기 ° C를 펠릿 세포 수 있습니다.
- 원심 분리 후 뜨는을 가만히 따르다. 적혈구에 의해 오염되지 않도록 10 ML 붉은 혈액 세포에서 세포 펠릿 (RBC) 7 분 상온에서 용해 버퍼를 Resuspend.
- 10 분 가만히 따르다 뜨는 1,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기 10 ML PBS 2.5 % FBS를 포함하는에있는 세포를 resuspend.
- 100 μL 나누어지는를 제거하고 죽은 세포를 제외 trypan 파랑을 사용하여 표준 hemacytometer를 사용하여 1:1000 희석에서 세포를 계산합니다. 약 20-30000000 세포가 비장마다 얻을 수 있습니다.
- 10 분 1000rpm에서 샘플을 원심 분리기 및 뜨는을 가만히 따르다.
- 0.5 % 90 μL 당 10 7 세포의 농도에서 BSA / PBS 포함 2mM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 펠렛을 Resuspend.
- 특히 비 - B 세포를 바인딩하는 세포 방지 CD43 항체 코팅 자기 구슬을 추가합니다. 90 μL 당 10 μL 비즈 (10 7 세포)를 사용합니다. 잘 믹스 4에서 품어 ° C를 20 분.
- 세포로 분류되었습니다되면, FBS / PBS는 튜브 맨 위로 2.5 %를 추가하여 그들을 씻으십시오. 10 분 1,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기.
- 뜨는을 가만히 따르다. ML 당 10x10 7 세포의 농도에서 0.1 % BSA / PBS에 세포를 Resuspend.
- 자기 분리기에 자기 정렬 칼럼을 마운트합니다. 흐름 -을 통해 수집하고 BSA / PBS 총리와 씻어 3mL 0.5 %로 컬럼을 읽어 직접 열을 아래 원뿔 튜브를 놓습니다.
- 세척 유체가 통과 거듭되면, 새 컬렉션 튜브로 교체하십시오. 샘플 미만 1 ML 경우, 0.5 % BSA / PBS / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 1 ML 샘플 볼륨을 조절하고 열에있는 샘플을로드합니다. 칼럼 당 세포의 1 ML 최대를로드하고 필요한 경우 여러 개의 컬럼을 사용합니다.
- 세포가 수동적으로 열의 컬럼을 통해 흐름과 원뿔 관에 언바운드 세포를 수집하도록 허용합니다. 0.5 %는 BSA / PBS -을 통해 플로우를 수집하기 위해 지속하면서 3 ML과 열 4 번 씻으십시오.
- 모두 CD43 음성 쉬고있는 B 세포가 풍부하게 될있는 흐름을 통해 수집합니다. 열을 삭제. 10 분 1,000 RPM의 흐름을 통해 원심 분리기.
- 뜨는 드레인 10 ML 매체 (15 % FCS / + 글루타민, 펜 / Strep, 비 필수 아미노산, 50 μm의 Β - ME)를 추가
- ML 당 10 6 세포에있는 세포와 문화를 계산합니다.
- B 세포 성장과 확산을 촉진하기 위해, 각각 최종 농도 20 μg / ML 및 1 μg / ML하는 등 재조합 IL - 4 및 안티 CD40 항체와 매체를 보완하고, 문화 플라스크에 세포를 전송합니다.
- 하룻밤 문화 셀을. 세포를 카운트하고 적절한 IL - 4 및 CD40를 추가, ML 당 10 6 세포로 희석.
- 바이러스 감염 전에 72 시간 문화 전지.
2. 제작자 세포 Transfection
양이온 lipids 또는 인산 칼슘을 사용하여 transfection을 위해 설립 프로토콜을 사용합니다. 접시 당 100 μg 플라스미드 DNA를 사용하여 DNA 구조 당 Transfect의 10cm 3 판. 우리는 일상적으로 칼슘 인산염 transfection 방법 13, 14을 사용하고 chloroquine과 함께 보충 때 높은 바이러스 titer를 적어 둡니다.
- 생산자 세포가 transfected 수로 60%에게 70 % 합류 피닉스 세포를 사용합니다. 이 코플루엔스 셀 카운트에서 10cm 접시 당 5,000,000 전지해야합니다.
- transfection하기 전에 한 시간, 피닉스 세포 성장을위한 새로운 완전한 미디어로 미디어를 교체하십시오.
- 멸균 eppendorpf 관에서 포장 구조 DNA, 0.5M CaCl 2 250 μL 100 μg을 결합하고, 멸균 물 500 μL에 최종 음량을 조절
- 1 ML 피펫을 사용하여 적극적으로 15mL 폴리 프로필렌 튜브 500 μL 배 HNP이 솔루션을 믹스
- 이 혼합물은 8-10분에 대한 실온에서 휴식을 허용합니다. 이 기간 동안 침전물이 형성됩니다.
- transfection 혼합 균일 내내 혼합물을 배포하는 매체를 소용돌이 치는 동안 세포 드롭 현명한을 추가합니다.
- 37 세포를 품어 ° C를 12 시간.
- 12시간 포스트 transfection은 8ml 전체 B 세포 성장 매체와 매체를 교체하고 37 ° C 배양기에 세포를 반환합니다.
3. 자극 지라 B 세포 감염
- 포스트 transfe 48hr 피닉스 세포의 표면에 뜨는 제거ction 및 세포 파편을 제거하는 0.2 미크론 필터를 통해 뜨는을 전달합니다.
- 3 ML 믹스 바이러스를 포함하는 미리 활성화 B 세포 (1 단계에서와 같이) 3 ML로 뜨는 있습니다. 세포에 바이러스 흡착을 향상시키기 위해서는, ML 당 16 μg의 최종 농도에 polybrene를 추가합니다.
- 30 90 분간 2500 rpm으로 원심 분리하여 세포를 감염 ° C.
- 37 이상 48-72 시간에 대한 품어 스핀, ° C는 세포 성장과 확산 수 있도록 즉시.
4. 유동세포계측법 분석
- 흐름 cytometer를 사용하여, B220 및 표면 IgG1의 표면 표현에 대한 세포를 분석할 수 있습니다. 세포의 표면에서 IgG1의 존재는 그 클래스 스위치 재조합이 AID 유전자의 retroviral complementation을 통해 성공적인 구조의 결과로 발생했습니다 나타냅니다.
5. 대표 결과
우리는 성공적으로 (AID - / -) AID - 결함에서 단백질 요소 활성화 유도 Cytidine의 Deaminase (AID)의 결핍을 구출해야 retroviral 전달을 사용하는 B - lymphocytes. 간단히, 우리는 pMX - 하녀 - GFP 15-18 피닉스 세포 transfecting하여 마우스 AID (하녀) 단백질을 표현하는 재조합 retroviruses를 생성. 수확 바이러스는 전 생체내 클래스 스위치 재조합 (CSR) 자극 조건 19 AID - 부족한 생쥐에서 얻은 AID - 결함 B 세포에 감염되었습니다. 감염된 B 세포는 다음 유동세포계측법 분석을 사용하는 문화에 72hrs 이후 CSR에 대한 IgG1을 분석했다. 그림 2는 CSR는 원조 표현 구조의 결과로 발생했음을 나타냅니다 AID가 아니라 비어있는 구조와 B 세포의 표면에 IgG1의 감지를 보여줍니다.
그림 1 : 생산 세포 내에서 retroviral 포장 제도 : 이전 15 설명된대로 Ψ로 표시 관심있는 유전자가,,, pMX - IRES - GFP에 subcloned되었습니다. 플라스미드는 인산 칼슘 방법 13, 14을 사용하여, 개그 - POL 및 봉투 단백질 (피닉스, Orbigen)를 생산 할 수 ecotropic 바이러스성 포장 세포주에 transfected되었습니다. 마흔 여덟 시간 transfection 후 뜨는 포함하는 바이러스성 입자는 생쥐에서 얻은 대상 기본 B 세포에 감염 수확했다.
그림 2 : AID 결함 B 세포는 안티 CD40로 자극하고 IL - 4 pMX - 메이드 - GFP 또는 혼자 GFP를 표현하는 레트로 바이러스를 포함하는 레트로 바이러스에 감염되었습니다. IgG1에 CSR의 수준은 외과의 분석에 의해 평가되었다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
lymphopoesis의 발달 이벤트의 많은가 transcriptional 규칙 1, 2에 의해 제어되기 때문에 그림 1에 여기에서 설명한과 같이 묘사 같은 지라 B 세포의 Retroviral 도입은 B - lymphocytes의 연구에 유용 유전자 접근 방식이다. CD40L를 통해 트리거링 B 세포 성숙의 나중 단계에서 B 세포 성장의 유도, 세포주기에 진입하고, 증식 11, 20 필수입니다. 그림 2에 표시된, B 세포는 확산이 버스트를 받아야하는 안티 - CD40과 IL4과 함께 체외로 자극하고, retroviral 벡터 B 세포 개발이 단계 동안 작동할 수 이상 - 특급 단백질에 유용한 도구 될 수 있습니다. 그림에 표시된 예제에서는. 2, 우리는 AID가 - 결함 CSR을 (여기서는 IgG1)를 거쳐 수없는 B 세포가 retrovirally 마우스 보조 유전자를 도입하여이 기능에 대한 구조될 수있다는 것을 보여준다. 이러한 접근 방식은 우리가 (그림 1 참조) CSR을받은 것을 (IgG1 + GFP +) GFP 양성 세포에 대해 추적할 수 있습니다.
이 방법은 유전자 변형 마우스를 만들려면 시간 투자 반대로 그것이 지라 수확 후 채 일주일에 완료 수에 마우스 모델링을 통해 유리한 것입니다. 분석의 유형은 탐정의 애플 리케이션에 맞게 수 있으며 여기에 우리는 그림 2에서와 같이 유동세포계측법에 의해 클래스 스위치 재조합의 분석을 제시했습니다. 또한,이 방법은 retrovirally - transduced 전지 15 21 일부터 단백질 추출에 따라 생화 학적 접근의 범위에 적합합니다.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
CK는 컬럼비아 대학 대학원 프로그램에 의해 지원됩니다. UB는 미국의 백혈병과 림프종 사회, 백혈병 연구 재단의 새로운 탐정 수상의 수신자의 연구원이며, 컬럼비아 대학 뉴 학부 시동 자금에 의해 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. Introduction to Genetic Analysis. , W. H. Freeman. New York. (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
