Summary
Um sistema eficiente de estrutura e análise da função de um gene em um
Abstract
A expressão de genes transgênicos em células eucarióticas é uma abordagem inversa poderosa genética em que um gene de interesse é expressa sob o controle de um sistema de expressão heteróloga para facilitar a análise do fenótipo resultante. Esta abordagem pode ser usada para expressar um gene que não é normalmente encontrado no organismo, para expressar uma forma mutante do gene de um produto, ou sobre-expressar uma forma dominante negativo do produto do gene. É particularmente útil no estudo do sistema hematopoético, onde a regulação da transcrição é um mecanismo de controle importante no desenvolvimento e diferenciação das células B 1, revisto em 2-4.
Rato genética é uma ferramenta poderosa para o estudo dos genes humanos e doenças. Uma análise comparativa do mouse e do genoma humano revela conservação da sintenia em mais de 90% do genoma 5. Além disso, grande parte da tecnologia usada em modelos do rato é aplicável ao estudo dos genes humanos, por exemplo, interrupções e substituição de genes alelos 6 . No entanto, a criação de um camundongo transgênico requer uma grande quantidade de recursos de natureza financeira e técnica. Vários projetos já começaram a compilar bibliotecas de knock out linhagens de camundongos (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) ou estirpes mutagênese induzida (RIKEN), que exigem esforços em larga escala e de colaboração 7. Portanto, é desejável para o primeiro estudo do fenótipo de um gene desejado em um modelo de cultura celular de células primárias antes de avançar para um modelo de mouse.
Retroviral DNA se integra ao DNA do hospedeiro, de preferência dentro ou perto de unidades de transcrição ou ilhas CpG, resultando em estável e hereditária expressão do gene de interesse embalados, evitando silenciamento transcricional 8 9. Os genes são transcritos, em seguida, sob o controle de um promotor retroviral de alta eficiência, resultando em uma alta eficiência de transcrição e produção de proteína. Portanto, a expressão retroviral pode ser usado com células que são difíceis de transfecção, desde as células estão em um estado ativo durante a mitose. Porque os genes estruturais do vírus estão contidos dentro da linha de célula de embalagem, os vetores de expressão usada para clonar o gene de interesse não contêm genes estruturais do vírus, que tanto elimina a possibilidade de revertentes viral e aumenta a segurança de trabalhar com sobrenadantes viral como não virions infecciosos são produzidos 10.
Aqui apresentamos um protocolo para a produção recombinante retroviral e subseqüente infecção de células B do baço. Após o isolamento, as células cultivadas esplênica são estimuladas com Th linfocinas derivadas e anti-CD40, o que induz a uma explosão de B proliferação e diferenciação celular 11. Este protocolo é ideal para o estudo de acontecimentos ocorridos no final B de desenvolvimento e diferenciação celular, como as células B são isolados do baço seguintes eventos iniciais hematopoéticas, mas antes da estimulação antigênica para induzir a diferenciação plasmocitária.
Protocol
1. Isolamento de Linfócitos B do baço e Estimulação
- Colher os baços de camundongos deficientes AID 12 entre 2-3 meses de idade. O isolamento do baço é realizada em condições estéreis e os órgãos mantidos temporariamente em soro fisiológico frio tampão fosfato (PBS) contendo 15% de soro fetal bovino (FBS).
- O baço é então transferido para um capuz estéreis de cultura de tecidos e homogeneizado em 5 mL de PBS suplementado com FBS 2,5%. Transferir o homogeneizado para um tubo falcon 15 mL.
- Centrifugar a amostra de tecido homogeneizado esplênica em 1000rpm por 10 minutos a 4 ° C para agregar as células.
- Decantar o sobrenadante após a centrifugação. Ressuspender o pellet celular em 10 mL de glóbulos vermelhos (RBC) tampão de lise em temperatura ambiente por 7 minutos para evitar a contaminação por células vermelhas do sangue.
- Centrífuga de amostra a 1000 rpm por 10 minutos e decantar o sobrenadante e ressuspender as células em 10 mL de PBS contendo 2,5% de SFB.
- Remover 100 mL alíquota e contar as células em uma diluição 1:1000 utilizando um hemocitômetro padrão usando azul de tripano para excluir as células mortas. Aproximadamente 20-30 milhões de células pode ser obtido por baço.
- Centrífuga de amostra em 1000rpm por 10 minutos e decantar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento em 0,5% BSA / PBS contendo 2mM EDTA, na concentração de 10 7 células por 90 mL.
- Adicionar anti-CD43 revestidas de anticorpo esferas magnéticas para as células a se ligam especificamente não-B células. Use 10 gotas mL por 90 mL (10 7 células). Misturar bem e incubar a 4 ° C por 20 minutos.
- Quando as células foram marcadas, lavá-los, adicionando 2,5% FBS / PBS para o topo do tubo. Centrífuga de amostra a 1000 rpm por 10 minutos.
- Decantar o sobrenadante. Ressuspender as células em 0,1% BSA / PBS na concentração de 10x10 7 células por ml.
- Montar uma coluna de classificação magnética em um separador magnético. Posição de um tubo cônico diretamente sob a coluna para coletar o fluxo através da coluna e carga com 3mL 0,5% BSA / PBS para preparar e lavar.
- Uma vez que o fluido de lavagem tem fluído através, substitua-o por um tubo de nova coleção. Se a amostra é inferior a 1 mL, ajustar o volume da amostra a 1 mL com 0,5% BSA / PBS / EDTA e carregar a amostra na coluna. Coloque apenas um máximo mL de células por coluna e use várias colunas se necessário.
- Permitir que as células passivamente o fluxo através da coluna e recolher as células não ligado no tubo cônico na coluna. Lavar a coluna 4 vezes com 3 mL de 0,5% BSA / PBS, continuando a recolher o escoamento.
- Recolher todo o fluxo por meio em que CD43 negativo células B em repouso será enriquecido. Descartar a coluna. Centrífuga de fluxo contínuo a 1000 rpm por 10 minutos.
- Drenar o sobrenadante e adicionar 10 mL de médio (15% FCS / + glutamina, Pen / Strep, não os aminoácidos essenciais, 50 mM Β-ME)
- Contagem de células e cultura em 10 6 células por ml.
- A fim de estimular o crescimento de células B e proliferação, complementar o meio com anticorpos recombinantes IL-4 e anti-CD40 de tal forma que a concentração final é de 20 mcg / mL e 1 mg / ml, respectivamente, e transferência das células para um balão cultura.
- Cultura das células durante a noite. Contagem de células e diluir a 10 6 células por ml, acrescentando IL-4 e CD40, conforme apropriado.
- Células de cultura por 72 horas antes da infecção viral.
2. Transfecção de células Produtor
Utilizam protocolos estabelecidos para transfecção usando lipídios catiônicos ou fosfato de cálcio. 10 centímetros transfectar 3 placas por construir DNA, usando 100 mg de DNA plasmídeo por placa. Nós usam rotineiramente o método de transfecção de fosfato de cálcio 13, 14 e nota título viral alta, quando suplementados com cloroquina.
- Use 60% -70% de células confluentes Phoenix como células produtor a ser transfectadas. Neste contagem de células confluência deve ser de 5 milhões de células por 10 placa cm.
- Uma hora antes da transfecção, substituir a mídia com nova mídia completo para Phoenix crescimento celular.
- Em um tubo estéril eppendorpf, combine 100 mg de embalagens construir DNA, 250 L de CaCl 2 0,5 M, e ajustar o volume final de 500 mL com água estéril
- Usando uma pipeta de 1 mL, vigorosamente mix esta solução com 500 mL 2X HNP em um tubo de polipropileno 15mL
- Permitir essa mistura descansar em temperatura ambiente por 80-10 minutos. Durante esse tempo, um precipitado se formará.
- Adicione a mistura de transfecção gota a gota, para as células enquanto agita o meio para distribuir a mistura por toda parte.
- Incubar as células a 37 ° C por 12 horas.
- 12 horas após a transfecção, substituir o meio com 8ml completa meio de crescimento de células B e as células voltem a 37 ° C incubadora.
3. Infecção de células B do baço Stimulated
- Remover o sobrenadante das células Phoenix 48hr pós-transfection e passar o sobrenadante através de um filtro de 0,2 mícron para remover quaisquer restos celulares.
- Mix 3 mL de vírus contendo o sobrenadante com 3 mL de células pré-ativadas B (como no passo 1). A fim de melhorar a adsorção viral para as células, adicionar polibrene numa concentração final de 16 mg por mL.
- Infectar as células por centrifugação a 2500 rpm por 90 minutos a 30 ° C.
- Imediatamente após o spin, incubar por mais 48-72 horas a 37 ° C para permitir o crescimento e proliferação celular.
4. Análise de Citometria de Fluxo
- Usando um citômetro de fluxo, analisar as células para a expressão de superfície de IgG1 B220 e de superfície. A presença de IgG1 na superfície das células indica que a recombinação mudança de classe tem ocorrido como resultado de resgate bem sucedido através da complementação retroviral do gene AID.
5. Resultados representante
Temos resgatado com sucesso a deficiência do fator de ativação da proteína Desaminase Citidina Induzida (AID) da AID-deficiente (AID-/ -) B-linfócitos usando transdução retroviral. Brevemente, geramos retrovírus recombinante expressando AID mouse (empregada) de proteína por transfecting células Phoenix com PMX-MAID-GFP 15-18. Os vírus colhidos foram infectadas em células-AID deficiente B obtidos AID camundongos deficientes em ex recombinação mudança de classe vivo (CSR) condições de estimulação 19. As células B infectadas foram então analisados para a RSE para IgG1 após 72h em cultura através da análise de citometria de fluxo. A Figura 2 mostra a detecção de IgG1 na superfície de células B, com ajuda, mas não construir o vazio, indicando que a RSE tem ocorrido como resultado de resgate expressão AID.
Figura 1: Esquema de embalagens retroviral no interior das células produtor: Gene de interesse, representada por Ψ, foi subclonado em PMX-IRES-GFP, como descrito anteriormente 15. O plasmídeo foi transfectado em uma linhagem de células viral embalagem ecotropic capaz de produzir gag-pol e proteína do envelope (Phoenix, Orbigen), utilizando o método de fosfato de cálcio 13, 14. Quarenta e oito horas após a transfecção, sobrenadante contendo partículas virais foi colhido para a infecção em células alvo principal B obtidas de camundongos.
Figura 2: células AID deficiente B, estimuladas com anti-CD40 e IL-4 foram infectados com um retrovírus contendo PMX-MAID GFP ou um retrovírus expressando GFP sozinho. O nível da RSE para IgG1 foi avaliada através da análise FACS.
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Discussion
Transdução retroviral de células B do baço, como descrito aqui e, conforme ilustrado na figura 1 é uma abordagem genética que é útil no estudo de linfócitos B, porque muitos dos eventos de desenvolvimento em lymphopoesis são controlados pela regulação da transcrição 1, 2. Nos estágios mais avançados da maturação das células B, provocando via CD40L é essencial para a indução de crescimento de células B, a entrada no ciclo celular, e proliferação de 11, 20. Conforme mostrado na Figura 2, as células B podem ser estimulados in vitro com anti-CD40 e IL4 submeter-se a esta explosão de proliferação, e vetores retrovirais são ferramentas úteis para sobre-expressar proteínas que podem funcionar durante estas fases de desenvolvimento das células B. No exemplo mostrado na figura. 2, demonstrar que o auxílio-deficiente células B que são incapazes de se submeter CSR (aqui para IgG1) podem ser resgatados para essa função por retrovirally introduzindo o gene AID mouse. Esta abordagem permite-nos acompanhar para GFP células positivas (ver figura 1) que foram submetidos a CSR (IgG1 + GFP +).
Este método é vantajoso em relação a modelagem do mouse na medida em que pode ser concluído em menos de uma semana após a colheita do baço ao contrário do investimento de tempo para criar um camundongo transgênico. O tipo de análise pode ser adaptado para aplicações do investigador, aqui nós apresentamos a análise de recombinação mudança de classe por citometria de fluxo, como na Figura 2. Além disso, este método é adequado para uma série de abordagens bioquímicas após a extração de proteínas das células-retrovirally transduzidas 15, 21.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
CK é suportado pelo programa de Pós-Graduação da Universidade Columbia. UB é membro da Leukemia and Lymphoma Society of America, o destinatário da New Investigator Award da Fundação de Pesquisa leucemia e é apoiado pela Columbia University New Faculdade start-up fundos.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
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