Summary
Un sistema eficiente de la estructura y análisis de la función de un gen en un
Abstract
La expresión transgénica de genes en células eucariotas, es un poderoso método de genética inversa en la que se expresa un gen de interés bajo el control de un sistema de expresión heteróloga para facilitar el análisis del fenotipo resultante. Este enfoque puede ser usado para expresar un gen que no se encuentra normalmente en el organismo, para expresar una forma mutante de un gen producto, o sobre-expresa una forma dominante negativa del producto del gen. Es particularmente útil en el estudio del sistema hematopoyético, que la regulación transcripcional es un mecanismo de control importante en el desarrollo y diferenciación de células B 1, revisada en 02.04.
La genética del ratón es una herramienta poderosa para el estudio de los genes y las enfermedades. Un análisis comparativo con el ratón y el genoma humano revela la conservación de synteny en más del 90% del genoma 5. Además, gran parte de la tecnología utilizada en modelos de ratón es aplicable al estudio de los genes humanos, por ejemplo, alteraciones de genes y la sustitución alélica 6 . Sin embargo, la creación de un ratón transgénico que requiere una gran cantidad de recursos tanto de carácter financiero y técnico. Varios proyectos han comenzado a compilar las bibliotecas de eliminar cepas de ratón (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) o mutagénesis inducida por las cepas (RIKEN), que requieren grandes esfuerzos y la colaboración 7. Por lo tanto, es deseable que el primer estudio del fenotipo de un gen deseado en un modelo de cultivo celular de células primarias antes de pasar a un modelo de ratón.
ADN retroviral se integra en el ADN del huésped, de preferencia dentro de o cerca de las unidades de transcripción o de las islas CpG, lo estable y heredable expresión del gen de empaquetado de interés y evitar el silenciamiento transcripcional 8 9. Los genes se transcriben bajo el control de un promotor de la eficiencia retroviral de alta, resultando en una alta eficiencia de la transcripción y la producción de proteínas. Por lo tanto, la expresión retroviral se puede utilizar con las células que son difíciles de transfectar, siempre y cuando las células están en un estado activo durante la mitosis. Debido a que los genes estructurales del virus se encuentran dentro de la línea celular de empaquetamiento, los vectores de expresión que se usa para clonar el gen de interés no contienen genes estructurales del virus, que no sólo elimina la posibilidad de reversiones viral y aumenta la seguridad de trabajar con los sobrenadantes virales como no viriones infecciosos se producen 10.
Aquí se presenta un protocolo para la producción recombinante de retrovirales y la posterior infección de las células B del bazo. Tras el aislamiento, las células del bazo cultivadas son estimulados con linfocinas Th derivados y anti-CD40, lo que induce a una explosión de la proliferación de células B y diferenciación 11. Este protocolo es ideal para el estudio de los acontecimientos que se presentan en el desarrollo de células B y la diferenciación, las células B están aislados del bazo tras los primeros eventos hematopoyéticas, pero antes de la estimulación antigénica para inducir la diferenciación plasmáticas.
Protocol
1. Esplénica B-linfocitos Aislamiento y estimulación
- Cosecha del bazo de los ratones con deficiencia de AID 12 entre 2-3 meses de edad. El aislamiento del bazo se lleva a cabo en condiciones estériles y los órganos se mantienen temporalmente en solución salina fría tampón fosfato (PBS) que contiene 15% de suero fetal bovino (SFB).
- El bazo es transferido a una campana de cultivo de tejidos estériles y se homogeneizaron en 5 ml de PBS suplementado con FBS al 2,5%. Transferir el homogeneizado a un tubo de 15 ml halcón.
- Centrifugar la muestra homogeneizada tejido esplénico a 1000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C para precipitar las células.
- Desechar el sobrenadante tras centrifugación. Resuspender el botón celular en 10 ml de glóbulos rojos (GR) de tampón de lisis a temperatura ambiente durante 7 minutos para evitar la contaminación por los glóbulos rojos.
- Centrifugar la muestra a 1000 rpm durante 10 minutos y el sobrenadante se decanta y resuspender las células en 10 ml de PBS que contenía 2,5% de SFB.
- Sacar 100 l alícuota y contar las células en una dilución 1:1000 con una hemocitómetro estándar con azul tripán para excluir la presencia de células muertas. Aproximadamente 20-30 millones de células se pueden obtener por el bazo.
- Centrifugar la muestra a 1000 rpm durante 10 minutos y decantar el sobrenadante.
- Resuspender el precipitado en 0,5% de BSA / PBS que contenía 2 mM EDTA a una concentración de 10 7 células por 90 mL.
- Añadir anti-CD43 anticuerpos magnéticas recubiertas de las células que se unen específicamente no-células B. Use 10 gotas por cada 90 l l (10 7 células). Mezclar bien e incubar a 4 ° C durante 20 minutos.
- Una vez que las células han sido etiquetados, lavarlas mediante la adición de 2,5% de SFB / PBS a parte superior del tubo. Centrifugar la muestra a 1000 rpm durante 10 minutos.
- Se decanta el sobrenadante. Resuspender las células en el 0,1% de BSA / PBS a una concentración de 10x10 7 células por ml.
- Montar una columna de ordenación magnética en un separador magnético. Posición de un tubo cónico directamente debajo de la columna para recoger el flujo a través de la carga y la columna con 3 ml 0,5% de BSA / PBS al primer y lavado.
- Una vez que el líquido de lavado ha fluido a través, reemplace con un tubo de la nueva colección. Si la muestra es menos de 1 ml, ajustar el volumen de muestra a 1 ml con 0,5% BSA / PBS / EDTA y la carga de la muestra en la columna. Cargue sólo un máximo ml de células por columna y el uso de varias columnas si es necesario.
- Permitir que las células de flujo de forma pasiva a través de la columna y recoger las células no consolidados en el tubo cónico en la columna. Lavar la columna 4 veces con 3 ml de 0,5% de BSA / PBS sin dejar de recoger el flujo continuo.
- Recoger todo el flujo a través de la cual las células CD43 negativo B en reposo se enriquecerá. Desechar la columna. Centrífuga de flujo continuo a 1000 rpm durante 10 minutos.
- Escurrir el sobrenadante y agregar 10 ml de medio (15% de FCS / + glutamina, penicilina / estreptomicina, no aminoácidos esenciales, 50 M Β-ME)
- Contar las células y la cultura a 10 6 células por ml.
- Con el fin de estimular el crecimiento de las células B y la proliferación, el suplemento del medio de anticuerpos recombinantes con IL-4 y anti-CD40 de manera que la concentración final de 20 mcg / ml y 1 mg / ml, respectivamente, y la transferencia de las células de un frasco de cultivo.
- Cultivar las células durante la noche. Recuento de células y diluir a 10 6 células por ml, la adición de IL-4 y CD40, según corresponda.
- Células en cultivo durante 72 horas antes de la infección viral.
2. La transfección de células productoras
Utilizar los protocolos establecidos para la transfección utilizando lípidos catiónicos o fosfato de calcio. 10 cm 3 transfectar placa por construcción de ADN, utilizando 100 mg de ADN plásmido por placa. Nosotros usamos el fosfato de calcio método de transfección 13, 14 y nota título viral alta cuando se complementa con la cloroquina.
- Use un 60% -70% confluente células como células productoras de Phoenix para ser transfectadas. En este recuento de células confluencia debe ser de 5 millones de células por placa de 10 cm.
- Una hora antes de la transfección, reemplazar los medios de comunicación con nuevos medios de comunicación completa para el crecimiento celular Phoenix.
- En un tubo estéril eppendorpf, se combinan 100 mg de envases construcción de ADN de 250 l de 0,5 M CaCl 2, y ajustar el volumen final de 500 ml con agua estéril
- Usando una pipeta de 1 mL, mezclar enérgicamente esta solución con 500 l de la Policía Nacional 2X un tubo de polipropileno de 15 ml
- Permita que esta mezcla a reposar a temperatura ambiente durante 8-10 minutos. Durante este tiempo se forma un precipitado.
- Añadir la mezcla de transfección, gota a gota a las células mientras agita el medio para distribuir uniformemente la mezcla de todo.
- Se incuban las células a 37 ° C durante 12 horas.
- 12 horas después de la transfección, reemplazar el medio con 8 ml medio de cultivo B celular completo y volver a las células a la incubadora a 37 ° C.
3. La infección de las células B estimuladas esplénica
- Aspirar el sobrenadante de las células Phoenix 48 horas de grabación después de transfección y pasar el sobrenadante a través de un filtro de 0,2 micrones para eliminar los desechos celulares.
- Mezclar 3 ml de virus que contienen sobrenadante con 3 ml de células B pre-activado (como en el paso 1). Con el fin de mejorar la adsorción viral a las células, agregar polibreno a una concentración final de 16 mg por ml.
- Infectar a las células por centrifugación a 2500 rpm durante 90 minutos a 30 ° C.
- Inmediatamente después de la vuelta, se incuban por un período de 48-72 horas a 37 ° C para permitir el crecimiento y proliferación celular.
4. Análisis por citometría de flujo
- El uso de un citómetro de flujo, análisis de las células de la superficie expresión de IgG1 B220 y la superficie. La presencia de IgG1 en la superficie de las células indica que la recombinación de cambio de clase se ha producido como consecuencia de rescate con éxito a través de la complementación retroviral del gen de la AID.
5. Resultados representante
Hemos logrado rescatar la deficiencia de la proteína del factor citidina deaminasa inducida por activación (AID) de la AID-deficiente (AID-/ -) a los linfocitos B con la transducción retroviral. En pocas palabras, generamos retrovirus recombinantes que expresan AID ratón (criada) de proteínas mediante transfección de células con Phoenix PMX-criada-GFP 15-18. El virus de la cosecha fueron infectadas en las células B deficiente AID-obtenidos a partir de ratones deficientes en el AID-ex vivo recombinación de cambio de clase (CSR) condiciones de estimulación 19. Las células B infectadas fueron analizadas para que la RSE IgG1 después de 72 horas en la cultura mediante el análisis de citometría de flujo. La figura 2 muestra la detección de IgG1 en la superficie de células B con la ayuda, pero no la construcción de vacío, lo que indica que la RSE se ha producido como resultado de una ayuda de salvamento de expresión.
Figura 1: Esquema de envases retroviral dentro de las células de productores: gen de interés, representados por Ψ, se subclonó en PMX-IRES-GFP, como se describió previamente 15. El plásmido se transfectadas en un ecotropic línea celular de empaquetamiento viral capaz de producir gag-pol y proteína de envoltura (Phoenix, Orbigen), utilizando el método de fosfato de calcio 13, 14. Cuarenta y ocho horas después de la transfección, el sobrenadante que contiene las partículas virales se cosechó para la infección en las células diana B primarios obtenidos de los ratones.
Figura 2: Las células deficientes en B AID, estimularon con anti-CD40 y la IL-4 fueron infectadas con un retrovirus que contiene PMX-criada-GFP o un retrovirus que expresa GFP sola. El nivel de la RSE a la IgG1 se evaluó mediante análisis FACS.
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Discussion
Transducción retroviral de células B del bazo como se describe y representa en la figura 1 es un método genético que es útil en el estudio de los linfocitos B, porque muchos de los acontecimientos de desarrollo en lymphopoesis son controlados por la regulación transcripcional de 1, 2. En las últimas etapas de maduración de las células B, activación a través de CD40L es esencial para la inducción del crecimiento de las células B, la entrada en el ciclo celular y la proliferación 11, 20. Como se muestra en la Figura 2, las células B pueden ser estimuladas in vitro con anti-CD40 y IL-4 a someterse a esta explosión de la proliferación, y los vectores retrovirales son herramientas útiles a la sobre-expresar proteínas que pueden funcionar durante estas etapas de desarrollo de las células B. En el ejemplo que se muestra en la figura. 2, que demostrar que la ayuda con deficiencia de células B que no pueden someterse a la RSE (en este caso a IgG1) pueden ser rescatados para esta función por retroviralmente la introducción del gen AID ratón. Este enfoque nos permite hacer un seguimiento de las buenas prácticas agrarias de células positivas (ver Figura 1) que han sido objeto de RSE (IgG1 + GFP +).
Este método es ventajoso en modelos de ratón en el que se puede completar en menos de una semana después de la cosecha del bazo en comparación con la inversión de tiempo para crear un ratón transgénico. El tipo de análisis se puede adaptar a las aplicaciones del investigador, aquí hemos presentado un análisis de la recombinación de cambio de clase por citometría de flujo como en la figura 2. Además, este método es adecuado para una amplia gama de enfoques bioquímicos después de la extracción de proteínas de las células transducidas retroviralmente-15, 21.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
CK es apoyado por la Universidad de Columbia programa de postgrado. UB es miembro de la Leukemia and Lymphoma Society of America, el destinatario del Premio al Investigador de la Fundación Nueva Investigación de Leucemia y el apoyo de la Universidad de Columbia de Nueva Facultad de fondos iniciales.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
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