Summary
Ett effektivt system för uppbyggnad och funktion analys av en gen i en
Abstract
De transgena uttrycket av gener i eukaryota celler är en kraftfull omvänd genetisk strategi, där en gen av intresse uttrycks under kontroll av en heterologa uttryck system för att underlätta analysen av den resulterande fenotyp. Denna metod kan användas för att uttrycka en gen som inte normalt finns i organismen, för att uttrycka en muterad form av en gen produkt, eller över-uttrycka en dominant-negativa formen av genen produkten. Det är särskilt användbart i studiet av hematopoetisk system, där transkriptionell reglering är en viktig kontrollmekanism i utveckling och differentiering av B-celler 1, över 2-4.
Musen genetik är ett kraftfullt verktyg för studier av mänskliga gener och sjukdomar. En jämförande analys av musens och människans arvsmassa avslöjar bevarande av synteny i över 90% av genomet 5. Dessutom är mycket av den teknik som används i musmodeller som gäller för studiet av mänskliga gener, exempelvis gen störningar och allela ersättare 6 . kräver dock skapandet av en transgen mus en hel del resurser av både en ekonomisk och teknisk natur. Flera projekt har börjat sammanställa bibliotek slå ut musstammar (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) eller mutagenes inducerad stammar (RIKEN), som kräver stora insatser och samverkan 7. Därför är det önskvärt att först studera fenotyp av en önskad gen i en cellkultur modell av galvaniska element innan du fortsätter till en musmodell.
Retroviral DNA integreras i den mottagande DNA, helst inom eller nära transkription enheter eller CpG öar, vilket resulterar i stabil och ärftliga uttryck för den paketerade genen av intresse och samtidigt undvika transkriptionell tysta 8 9. Generna är sedan skrivits under kontroll av en hög effektivitet retrovirus promotor, vilket resulterar i en hög effektivitet i transkription och protein produktion. Därför kan retrovirus uttryck användas med celler som är svåra att transfektera, förutsatt att cellerna är i aktivt läge under mitosen. Eftersom den strukturella generna av viruset finns i förpackningen cellinje, uttrycket vektorer som används för att klona genen av intresse innehåller inga strukturella gener av virus, som både eliminerar risken för virus revertants och ökar säkerheten i arbetet med viral supernatanterna eftersom ingen smittsam virioner produceras 10.
Här presenterar vi ett protokoll för rekombinant retrovirus produktion och efterföljande infektion av mjältens B-celler. Efter isolering är de odlade mjälten cellerna stimuleras med Th härrör lymfokiner och anti-CD40, som framkallar en explosion av B celltillväxt och differentiering 11. Detta protokoll är idealisk för att studera händelser som inträffar sent i B-celler utveckling och differentiering, liksom B-celler är isolerade från mjälten följande inledande hematopoetisk händelser men före antigen stimulering för att framkalla plasmacytic differentiering.
Protocol
1. Mjälten B-lymfocyter Isolering och stimulans
- Skörda mjälte från AID-brist möss 12 mellan 2-3 månaders ålder. Isolering av mjälte utförs under sterila förhållanden och organen hålls tillfälligt i kallt fosfatbuffert saltlösning (PBS) som innehåller 15% fetalt bovint serum (FBS).
- Mjälten överförs sedan till en steril vävnadsodling huva och homogeniseras i 5 mL PBS kompletterad med 2,5% FBS. Överför homogenatet till en 15 ml Falcon rör.
- Centrifugera det homogeniserade mjälten vävnadsprov vid 1000rpm i 10 minuter vid 4 ° C till pellets cellerna.
- Dekantera supernatanten efter centrifugering. Resuspendera cellpelleten i 10 ml röda blodkroppar (RBC) lyseringsbuffert i rumstemperatur i 7 minuter för att undvika föroreningar av röda blodkroppar.
- Centrifugera provet vid 1000 rpm i 10 minuter och dekantera supernatanten och suspendera cellerna i 10 ml PBS med 2,5% FBS.
- Ta bort 100 mikroliter delprov och räkna cellerna på en 1:1000 spädning med en standard hemacytometer med trypan blå för att utesluta döda celler. Ungefär 20-30 miljoner celler kan erhållas per mjälte.
- Centrifugera provet vid 1000rpm i 10 minuter och dekantera supernatanten.
- Återsuspendera pelleten i 0,5% BSA / PBS innehållande 2 mm EDTA vid en koncentration av 10 7 celler per 90 mikroliter.
- Lägg till anti-CD43-antikropp magnetiska kulor till cellerna för att specifikt binda icke-B-celler. Använd 10 mikroliter pärlor per 90 mikroliter (10 7 celler). Blanda väl och inkubera vid 4 ° C i 20 minuter.
- När celler har märkts, tvätta dem genom att lägga till 2,5% FBS / PBS till toppen av röret. Centrifugera provet vid 1000 rpm i 10 minuter.
- Häll av supernatanten. Resuspendera cellerna i 0,1% BSA / PBS vid en koncentration av 10x10 7 celler per ml.
- Montera en magnetisk sortering kolumn på en magnetisk separator. Placera en konisk tub direkt under kolumnen för att samla genomströmning och ladda kolonnen med 3 ml 0,5% BSA / PBS att prima och tvätta.
- När tvättvätskan har passerat ersätta med en ny kollektion rör. Om provet är mindre än 1 ml, justera provvolym till 1 ml med 0,5% BSA / PBS / EDTA och ladda provet i kolonnen. Fyll bara 1 ml högst celler per kolonn och använder flera kolumner om det behövs.
- Låt cellerna att passivt flöde genom kolonnen och samla den obundna celler i den koniska röret under kolumnen. Tvätta kolonnen 4 gånger med 3 mL 0,5% BSA / PBS samtidigt som man fortsätter att samla in flödet igenom.
- Samla alla genomströmning där CD43 negativ vilande B-celler kommer att berikas. Kasta kolumnen. Centrifugera genomströmning vid 1000 rpm i 10 minuter.
- Tappa supernatanten och tillsätt 10 ml medelstora (15% FCS / + glutamin, Pen / Strep, icke-essentiella aminosyror, 50 mikroM Β-ME)
- Räkna celler och kulturen på 10 6 celler per ml.
- För att stimulera B-celler tillväxt och spridning, komplettera medium med rekombinanta IL-4 och anti-CD40-antikropp så att den slutliga koncentrationer 20 mikrogram / ml och 1 mikrogram / ml, och överföra celler till en kultur kolv.
- Kultur cellerna natten. Räkna celler och späd till 10 6 celler per ml, lägga IL-4 och CD40 som är lämpligt.
- Kultur celler för 72 timmar innan virusinfektion.
2. Transfektion av Producent celler
Använda etablerade protokoll för transfektion med antingen katjoniska lipider eller kalciumfosfat. Transfektera 10cm 3 tallriken per DNA-konstruktion, med 100 mikrogram plasmid-DNA per platta. Vi använder rutinmässigt kalcium metod fosfat transfektion 13, 14 och notera höga virus titer de kompletteras med klorokin.
- Använd 60% -70% konfluenta Phoenix celler som producent celler som skall transfekterade. Vid denna sammanflödet celler skall vara 5 miljoner celler per 10 cm platta.
- En timme före transfektion, byta media med färska komplett media för Phoenix celltillväxt.
- I ett sterilt eppendorpf tub, kombinera 100 mikrogram av förpackningar bygga DNA, 250 mikroliter av 0,5 M CaCl 2 och justera den slutliga volymen till 500 mikroliter med sterilt vatten
- Använda en 1 ml pipett kraftfullt blandas denna lösning med 500 mikroliter 2X HNP i en 15ml polypropylen rör
- Låt denna blandning för att vila i rumstemperatur i 8-10 minuter. Under denna tid en fällning bildas.
- Tillsätt transfektion blandningen droppvis till cellerna samtidigt snurra på medellång och fördela blandningen över hela.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i 12 timmar.
- 12 timmar efter transfektion, ersätt medium med 8ml komplett B-cellernas tillväxt medium och tillbaka cellerna till 37 ° C inkubator.
3. Infektion av stimulering av mjälten B-celler
- Avlägsna supernatanten från Phoenix celler 48hr efter transfeInsatser och passera supernatanten genom ett 0,2 mikron filter för att avlägsna celler skräp.
- Blanda 3 mL av virus som innehåller supernatanten med 3 mL föraktiverade B-celler (som i steg 1). För att öka virus adsorption till cellerna, lägga polybrene till en slutlig koncentration av 16 mikrogram per ml.
- Infektera cellerna genom centrifugering vid 2500 rpm i 90 minuter vid 30 ° C.
- Omedelbart efter spinn, inkubera under ytterligare 48-72 timmar vid 37 ° C för att möjliggöra för celltillväxt och spridning.
4. Flödescytometrisk analys
- Med hjälp av en flödescytometer, analysera cellerna för utanpåliggande uttryck för B220 och yta IgG1. Förekomsten av IgG1 på ytan av de celler visar att klassen växla rekombination har skett som en följd av framgångsrika rädda via retrovirala komplettering av AID-genen.
5. Representativa resultat
Vi har framgångsrikt räddade brist på proteinet faktor Aktivering Induced cytidindeaminas (AID) från stöd-brist (AID-/ -) B-lymfocyter med hjälp av retrovirala transduktion. Kort sagt, genererade vi rekombinant retrovirus uttrycker musen STÖD (Maid) protein genom transfecting Phoenix celler med PMX-Maid-GFP 15-18. De skördade virus infekterade av stöd-brist B-celler som erhållits från stöd-brist möss i ex vivo klass växla rekombination (CSR) stimulering villkor 19. Den infekterade B-celler har sedan analyserats för företagens sociala ansvar att IgG1 efter 72 timmar i kulturen med hjälp av analys flödescytometri. Figur 2 visar att upptäcka IgG1 på ytan av B-celler med stödet men inte den tomma konstruera, vilket tyder på att CSR har inträffat som ett resultat av AID uttryck räddning.
Figur 1: Ordning för retrovirus förpackningar producent celler: Gene av intresse, företrädd av Ψ var subcloned i PMX-IRES-GFP, som tidigare beskrivits 15. Den plasmid var transfekterade till en ecotropic virus förpackningar cellinje som kan producera gag-pol och kuvert protein (Phoenix, Orbigen), med metod kalciumfosfat 13, 14. Fyrtioåtta timmar efter transfektion var supernatanten som innehåller viruspartiklar skördas för infektion i målet primära B-celler från möss.
Figur 2: STÖD bristfälliga B-celler, stimuleras med anti-CD40 och IL-4 var infekterade med ett retrovirus som innehåller PMX-Maid-GFP eller ett retrovirus som uttrycker GFP ensam. Nivån på CSR till IgG1 utvärderades av FACS analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retroviral transduktion av mjälten B-celler som beskrivs här och som avbildas i figur 1 är en genetisk metod som är användbar i studiet av B-lymfocyter eftersom många av de utvecklings-evenemang i lymphopoesis styrs av transkriptionell reglering 1, 2. I de senare stadierna av B cellmognaden triggning via CD40L är nödvändig för induktion av B-cellernas tillväxt, tas i cellcykeln och spridning 11, 20. Som visas i figur 2, kan B-celler stimuleras in vitro med anti-CD40 och IL4 att genomgå denna explosion av spridning och retrovirala vektorer är användbara verktyg för att över-uttrycka proteiner som kan fungera under dessa stadier av B-celler utveckling. I exemplet som visas i bild. 2, visar vi att stöd-brist kan B-celler som inte har möjlighet att genomgå CSR (här IgG1) räddas för denna funktion genom att retrovirally införa genen musen AID. Detta tillvägagångssätt tillåter oss att spåra för GFP-positiva celler (se figur 1) som har genomgått CSR (IgG1 + GFP +).
Denna metod är fördelaktig över musen modellering i att den kan genomföras på mindre än en vecka efter mjälten skörd i motsats till den investering i tid för att skapa en transgen mus. Den typ av analys kan anpassas till utredarens applikationer, här har vi presenterat en analys av klass växla rekombination med flödescytometri som i figur 2. Dessutom är denna metod lämplig för en rad biokemiska metoder efter protein extraktion från retrovirally-transduced celler 15, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
CK stöds av Columbia University Graduate program. UB är Fellow vid leukemi och lymfom Society of America, mottagaren av New Investigator Award från leukemi Research Foundation och stöds av Columbia University ny fakultet starta fonder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. Introduction to Genetic Analysis. , W. H. Freeman. New York. (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
