Summary
نظام فعال لهيكل وتحليل وظيفة الجين في
Abstract
التعبير عن الجينات المعدلة وراثيا في الخلايا حقيقية النواة هي قوية نهج الجينية العكسية التي يتم التعبير عن الجينات في المصالح الخاضعة لسيطرة نظام تعبير مغايرة لتسهيل تحليل النمط الظاهري الناتج. ويمكن استخدام هذه الطريقة للتعبير عن الجينات التي لا توجد عادة في الكائن الحي ، للتعبير عن شكل متحولة من منتج الجين ، أو المبالغة في التعبير عن الشكل السائد السلبية للمنتج الجين. انها مفيدة بشكل خاص في دراسة النظام hematopoetic حيث التنظيم الترانسكربتي آلية رقابية كبرى في تطوير وتمايز الخلايا باء (1) ، واستعرض في 2-4.
الماوس الوراثة هو أداة قوية لدراسة الجينات البشرية والأمراض. تحليل مقارن للفأرة والجينوم البشري يكشف حفظ تصاحب جيني في أكثر من 90 ٪ من الجينوم 5 ، وأيضا الكثير من التكنولوجيا المستخدمة في نماذج الماوس ينطبق على دراسة الجينات البشرية ، على سبيل المثال ، والاضطرابات الجينية واستبدال أليلية 6 ومع ذلك ، فإن إنشاء ماوس المعدلة وراثيا يتطلب قدرا كبيرا من الموارد الطبيعة على حد سواء المالية والتقنية. وقد بدأت عدة مشاريع لتجميع مكتبات ضرب سلالات الماوس (KOMP ، EUCOMM ، NorCOMM) أو الطفرات المستحثة سلالات (بتبريد) ، والتي تتطلب جهودا واسعة النطاق والتعاون 7. ولذلك ، فمن المستحسن أن أول دراسة على النمط الظاهري من الجين المطلوب في نموذج خلية ثقافة الخلايا الأولية قبل التقدم إلى نموذج الفأر.
فيروسات الحمض النووي DNA يدمج المضيفة ، ويفضل أن يكون داخل أو بالقرب من وحدة النسخ أو الجزر CPG ، مما أدى إلى مستقر وراثية التعبير عن الجينات وتعبئتها من الفائدة بينما تجنب إسكات الترانسكربتي 8 9. وكتب بعد ذلك الجينات تحت سيطرة أحد المروجين فيروسات كفاءة عالية ، مما أدى إلى كفاءة عالية من النسخ وإنتاج البروتين. ولذلك ، يمكن استخدام التعبير فيروسات مع الخلايا التي يصعب transfect ، شريطة أن الخلايا في حالة نشطة خلال الانقسام. لأن ترد الجينات الهيكلية للفيروس داخل العبوة خط الخلية ، وناقلات التعبير المستخدم لاستنساخ الجينات في المصالح لا تحتوي على جينات الفيروس الهيكلية ، وكلاهما يلغي احتمال revertants الفيروسية ويزيد من سلامة العمل مع supernatants الفيروسية كما يتم إنتاج أي virions المعدية 10.
هنا نقدم مشروع بروتوكول لإنتاج فيروسات المؤتلف والعدوى اللاحقة من الخلايا باء الطحال. بعد العزلة ، ويتم تحفيز الخلايا المستزرعة الطحال مع ث lymphokines المشتقة ومعاداة CD40 ، والذي يدفع إلى موجة عارمة من انتشار الخلايا والتمايز ب 11. هذا البروتوكول هو مثالي لدراسة الأحداث التي وقعت في وقت متأخر من تطوير خلايا B وتمايز ، حيث يتم عزل الخلايا البائية من الأحداث التالية الطحال hematopoetic الأولي ولكن قبل التحفيز مستضدي للحث على تمايز بلازماوي.
Protocol
1. الطحال الليمفاوية B - العزل وتحفيز
- حصاد الطحال من الفئران التي تعاني من نقص المعونة 12 بين 2-3 أشهر من العمر. يتم تنفيذ عزل الطحال في ظروف معقمة ويتم الاحتفاظ مؤقتا في أجهزة المالحة الباردة العازلة الفوسفات (PBS) التي تحتوي على 15 ٪ مصل بقري جنيني (FBS).
- ثم يتم نقل الطحال لغطاء نسيج الثقافة العقيمة والمتجانس في 5 مل من برنامج تلفزيوني تستكمل مع FBS 2.5 ٪. نقل جناسة لأنبوب 15 مل الصقر.
- أجهزة الطرد المركزي لعينة نسيج متجانس الطحال في 1000rpm لمدة 10 دقائق على 4 إلى خلايا بيليه درجة مئوية.
- صب وطاف بعد الطرد المركزي. Resuspend بيليه في الخلية في 10 مل من خلايا الدم الحمراء (RBC) العازلة تحلل في درجة حرارة الغرفة لمدة 7 دقائق لتجنب التلوث بواسطة خلايا الدم الحمراء.
- عينة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق ، وسكب وطاف resuspend الخلايا في 10 مل تحتوي على 2.5 ٪ PBS FBS.
- إزالة 100 ميكرولتر قسامة وعدد الخلايا في التخفيف 1:1000 باستخدام عدادة الكريات قياسي باستخدام التريبان الأزرق لاستبعاد أي خلايا ميتة. ويمكن الحصول على الخلايا حوالي 2-30 في الطحال.
- عينة الطرد المركزي في 1000rpm لمدة 10 دقائق ، وطاف في صب.
- Resuspend الكرية 0.5 ٪ في جيش صرب البوسنة / PBS 2mm والتي تحتوي على EDTA بتركيز 10 7 90 خلية لكل ميكرولتر.
- إضافة مكافحة CD43 الأجسام المضادة الخرز المغناطيسي المغلفة لخلايا لربط غير محدد B الخلايا. استخدام الخرز 10 ميكرولتر بنسبة 90 ميكرولتر (10 7 خلايا). مزيج جيد واحتضان عند 4 لمدة 20 دقيقة درجة مئوية.
- بمجرد تسمية الخلايا ، ويغسل لهم بإضافة 2.5 ٪ FBS / PBS إلى رأس الأنبوب. عينة الطرد المركزي في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة.
- صب وطاف. Resuspend الخلايا في 0.1 ٪ BSA / PBS بتركيز 10x10 7 خلايا لكل مل.
- جبل عمود الفرز المغناطيسي على فاصل المغناطيسي. موقف انبوب مخروطي مباشرة أسفل العمود لجمع التدفق من خلال وتحميل العمود مع 0.5 ٪ 3mL جيش صرب البوسنة / PBS لرئيس الوزراء ويغسل.
- بمجرد أن يغسل السائل قد تدفقت من خلال استبدال أنبوب المجموعة الجديدة. إذا كانت العينة أقل من 1 مل ، وضبط حجم العينة إلى 1 مل من 0.5 ٪ مع جيش صرب البوسنة / PBS / EDTA وتحميل العينة في العمود. تحميل فقط كحد أقصى 1 مل من الخلايا في العمود واستخدام أعمدة متعددة إذا لزم الأمر.
- تسمح هذه الخلايا إلى تدفق سلبي من خلال عمود ، وجمع الخلايا غير منضم في أنبوب مخروطي تحت العمود. غسل العمود 4 مرات مع 3 مل من 0.5 ٪ BSA / برنامج تلفزيوني مع الاستمرار في جمع من خلال تدفق.
- جمع كل التدفق من خلال التي سيتم المخصب CD43 السلبية خلايا B يستريح. تجاهل العمود. أجهزة الطرد المركزي في التدفق من خلال 1000 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة.
- استنزاف طاف وإضافة 10 مل المتوسطة (15 ٪ FCS / + الجلوتامين ، القلم / بكتيريا ، غير الأحماض الأمينية الأساسية ، و 50 ميكرومتر Β - ME)
- عدد الخلايا في الخلايا والثقافة في 6 10 مل.
- من أجل تحفيز نمو الخلايا وباء انتشار الأسلحة النووية ، مع استكمال المتوسطة المؤتلف الضد IL - 4 - CD40 ومكافحة مثل هذه التركيزات النهائية هي 20 ميكروغرام / مل و 1 ميكروغرام / مل على التوالي ، ونقل الخلايا إلى قارورة الثقافة.
- ثقافة الخلايا بين عشية وضحاها. عدد الخلايا والخلايا لتمييع 6 10 لكل لتر ، مضيفا IL - 4 و CD40 ، حسب الاقتضاء.
- ثقافة الخلايا لمدة 72 ساعة قبل أن العدوى الفيروسية.
2. ترنسفكأيشن من الخلايا المنتجة
استخدام البروتوكولات المعمول بها لترنسفكأيشن باستخدام الدهون الموجبة أو فوسفات الكالسيوم. Transfect 10cm 3 لوحة في بناء الحمض النووي ، وذلك باستخدام الحمض النووي 100 ميكروغرام البلازميد في اللوحة. نحن نستخدم أسلوب روتيني ترنسفكأيشن الكالسيوم الفوسفات 13 و 14 و علما عيار الفيروسية عالية عندما تستكمل مع الكلوروكين.
- استخدام 60 ٪ -70 ٪ متموجة فينيكس الخلايا لتكون خلايا transfected المنتجة. وينبغي في هذه التقاء خلايا تكون 5 ملايين الخلايا في الصفيحة 10 سم.
- ساعة واحدة قبل ترنسفكأيشن ، استبدال وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام كاملة جديدة لنمو الخلايا فينيكس.
- في أنبوب eppendorpf العقيمة ، والجمع بين 100 ميكروغرام من التعبئة والتغليف بناء الحمض النووي ، و 250 ميكرولتر من 0.5M CaCl 2 ، وضبط حجم النهائية إلى 500 ميكرولتر مع الماء المعقم
- 1 مل باستخدام ماصة ، مزيج بقوة هذا الحل مع الشرطة الوطنية الهايتية 500 2X ميكرولتر في أنبوب البولي بروبلين 15mL
- يسمح هذا الخليط للراحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 8-10 دقائق. خلال هذا الوقت سوف يعجل النموذج.
- إضافة خليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا ، بينما تراجع الحكمة يحوم المتوسط لتوزيع الخليط بالتساوي في جميع أنحاء.
- احتضان الخلايا في 37 ساعة لمدة 12 درجة مئوية.
- 12 ساعة بعد ترنسفكأيشن ، استبدال المتوسطة مع 8ml المتوسطة باء كاملة نمو الخلايا واعادة الخلايا الحاضنة 37 درجة مئوية.
3. إصابة تتنبه خلايا الطحال B
- طاف إزالة الخلايا من فينيكس 48hr بعد transfection وتمرير طاف عبر مرشح 0.2 ميكرون لإزالة أي حطام خلية.
- 3 مل من مزيج من الفيروسات التي تحتوي على طاف مع 3 مل من الخلايا B مفعلة مسبقا (كما في الخطوة 1). من أجل تعزيز امتصاص الخلايا الفيروسية ل، إضافة polybrene بتركيز نهائي من 16 ميكروغرام لكل مليلتر.
- تصيب الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 2500 دورة في الدقيقة لمدة 90 دقائق حتى 30 درجة مئوية.
- مباشرة بعد زيادة ونقصان ، لاحتضان المزيد من 48-72 ساعة عند 37 درجة مئوية للسماح لنمو الخلايا وانتشارها.
4. تحليل التدفق الخلوي
- باستخدام عداد الكريات تدفق وتحليل الخلايا للتعبير عن سطح IgG1 B220 والسطحي. وجود IgG1 على سطح الخلايا يشير إلى أن فئة التوحد التحول قد حدث نتيجة لانقاذ ناجحة عبر تكامل فيروسات من الجين AID.
5. ممثل النتائج
انقذت نجحنا في نقص عامل تنشيط بروتين نازعة أمين سيتيدين المستحثة (AID) من نقص - AID (AID / --) باستخدام الخلايا الليمفاوية B - تنبيغ فيروسات. باختصار ، ولدت لنا التعبير عن الفيروسات القهقرية المؤتلف AID الماوس (خادمة) البروتين transfecting الخلايا مع فينيكس PMX - GFP - خادمة 15-18. وكانت المصابة بالفيروسات التي تحصد في خلايا B - AID ناقصة تم الحصول عليها من المساعدات الفئران التي تعاني من نقص في الصف خارج الحي تأشب التبديل (CSR) شروط التحفيز 19. ثم تم تحليل الخلايا المصابة ب المسؤولية الاجتماعية للشركات لIgG1 بعد 72hrs في الثقافة باستخدام تحليل التدفق الخلوي. الشكل 2 يبين كشف IgG1 على سطح الخلايا البائية مع مساعدات ولكن ليس بناء فارغ ، مشيرا إلى أن المسؤولية الاجتماعية للشركات قد حدث نتيجة لانقاذ التعبير AID.
الشكل 1 : مخطط من التعبئة والتغليف فيروس داخل الخلايا المنتجة : تم subcloned الجينات في المصالح ، ويمثلها Ψ ، في PMX - IRES - GFP ، كما هو موضح سابقا 15. وكان transfected البلازميد الى ecotropic الفيروسية تغليف خط الخلية قادرة على انتاج هفوة بول والبروتين المغلف (فينيكس ، Orbigen) ، وذلك باستخدام الأسلوب فوسفات الكالسيوم 13 و 14. ثمان وأربعين ساعة بعد ترنسفكأيشن ، كان حصادها طاف الجسيمات الفيروسية التي تحتوي على العدوى إلى خلايا الهدف الأساسي B تم الحصول عليها من الفئران.
الشكل 2 : خلايا B AID منقوصة ، مع حفز CD40 المضادة للطائرات وأصيب IL - 4 مع الارتجاعي تحتوي PMX - خادمة GFP الارتجاعي أو التعبير عن GFP وحدها. كما تم تقييم مستوى المسؤولية الاجتماعية للشركات من خلال تحليل IgG1 FACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تنبيغ فيروسات من خلايا الطحال B كما هو موضح هنا ، وكما هو مبين في الشكل رقم 1 هو نهج الوراثية يمكن أن يكون مفيدا في دراسة الخلايا الليمفاوية B - لأن يتم التحكم في العديد من الفعاليات التنموية في lymphopoesis عن طريق التنظيم الترانسكربتي 1 و 2. في مراحل لاحقة من نضوج الخلايا B ، عبر إحداث CD40L ضروري لتحريض نمو الخلايا B ، ودخول دورة الخلية ، وانتشار 11 و 20. كما هو مبين في الشكل 2 ، ويمكن تحفيز الخلايا البائية في المختبر مع CD40 المضادة للطائرات وIL4 الخضوع لهذا الاندفاع من انتشار الأسلحة النووية ، وناقلات فيروسات هي أدوات مفيدة لأكثر تعبر عن البروتينات التي يمكن أن تعمل خلال هذه المراحل من تطور الخلايا باء. في المثال هو موضح في الشكل. 2 ، علينا أن نظهر أن المعونة التي تعاني من نقص يمكن انقاذ خلايا B التي لا تتمكن من الخضوع المسؤولية الاجتماعية للشركات (هنا لIgG1) لهذه المهمة من خلال تقديم مساعدات retrovirally الجين الماوس. هذا الأسلوب يتيح لنا الطريق الصحيح لGFP إيجابية الخلايا (انظر الشكل 1) التي خضعت المسؤولية الاجتماعية للشركات (GFP IgG1 + +).
هذا الأسلوب هو مفيد أكثر من الماوس في النمذجة التي يمكن الانتهاء منه في أقل من أسبوع واحد بعد الحصاد الطحال خلافا لاستثمار الوقت لخلق الفأر المعدل وراثيا. ويمكن تفصيل النوع من التحليل لطلبات المحقق ، وهنا قدمنا تحليل تأشب تبديل الطبقة التي التدفق الخلوي كما في الشكل 2. بالإضافة إلى ذلك ، هذا الأسلوب غير مناسب لطائفة من النهج البيوكيميائية التالية استخراج البروتين من الخلايا retrovirally transduced - 15 ، 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
معتمد من قبل البرنامج CK الدراسات العليا في جامعة كولومبيا. UB هو زميل اللوكيميا وسرطان الغدد الليمفاوية جمعية الأمريكية ، وحاصل على جائزة الباحث جديد من مؤسسة أبحاث اللوكيميا ومعتمد من قبل جامعة كلية كولومبيا الجديد البدء الأموال.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. Introduction to Genetic Analysis. , W. H. Freeman. New York. (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
