Summary
Een efficiënt systeem van de structuur en functie analyse van een gen in een
Abstract
De transgene expressie van genen in eukaryote cellen is een krachtig reverse genetische benadering, waarin een gen van belang wordt uitgedrukt onder de controle van een heterologe expressie systeem om de analyse van de resulterende fenotype te vergemakkelijken. Deze benadering kan worden gebruikt om een gen dat normaal gesproken niet wordt gevonden in het organisme te uiten, om een gemuteerde vorm van een genproduct te drukken, of om over-express een dominant-negatieve vorm van het gen product. Het is bijzonder nuttig in de studie van het hematopoëtische systeem, waar transcriptionele regulatie is een belangrijk controlemechanisme in de ontwikkeling en differentiatie van B-cellen een, beoordeeld in 2-4.
Muis genetica is een krachtig hulpmiddel voor de studie van de menselijke genen en ziekten. Een vergelijkende analyse van de muis en het menselijk genoom onthult de instandhouding van synteny in meer dan 90% van het genoom 5. Ook veel van de technologie die gebruikt wordt in muismodellen is van toepassing op de studie van de menselijke genen, bijvoorbeeld, gen storingen en allelische vervanging van 6 . Echter, de oprichting van een transgene muis vereist een groot deel van de middelen van zowel een financiële en technische aard. Verschillende projecten zijn begonnen met bibliotheken van knock-out muizen stammen (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) of mutagenese geïnduceerde stammen (RIKEN), die op grote schaal inspanningen en samenwerking vergen 7 samen te stellen. Daarom is het wenselijk om eerst onderzoek naar het fenotype van een gewenste gen in een cel cultuur model van de primaire cellen alvorens aan een muis model.
Retrovirale DNA integreert in het gastheer-DNA, bij voorkeur binnen of in de buurt transcriptie-eenheden of CpG eilanden, wat resulteert in een stabiele en erfelijke expressie van het verpakte gen van belang terwijl het vermijden van transcriptionele zwijgen 8 9. De genen worden dan overgeschreven onder de controle van een hoog rendement retrovirale promotor, wat resulteert in een hoge efficiëntie van transcriptie en eiwitproductie. Daarom kan retrovirale expressie worden gebruikt met cellen die zijn moeilijk te transfecteren, op voorwaarde dat de cellen zich in een actieve toestand tijdens de mitose. Omdat de structurele genen van het virus zijn vervat in de verpakking cellijn, de expressievectoren gebruikt om het gen van belang kloon bevatten geen structurele genen van het virus, die zowel de mogelijkheid van virale revertanten elimineert en verhoogt de veiligheid van het werken met virale supernatant als er geen besmettelijke virionen worden geproduceerd 10.
Hier presenteren wij een protocol voor recombinante retrovirale de productie en de latere infectie van de milt B-cellen. Na isolatie worden de gekweekte milt cellen gestimuleerd met Th afgeleid lymfokinen en anti-CD40, die een uitbarsting van B-cel proliferatie en differentiatie 11 induceert. Dit protocol is ideaal voor de studie van de gebeurtenissen laat in B-cel ontwikkeling en differentiatie, zoals B-cellen worden geïsoleerd uit de milt volgende eerste hematopoëtische gebeurtenissen, maar voorafgaand aan de antigene stimulatie om plasmacytic differentiatie te induceren.
Protocol
1. Milt B-lymfocyten isolatie en stimulatie
- Oogst de milt van AID-deficiënte muizen 12 tussen de 2-3 maanden oud. De isolatie van milt is uitgevoerd in steriele omstandigheden en de organen worden tijdelijk bewaard in een koude fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS) met 15% foetaal bovine serum (FBS).
- De milt wordt dan overgebracht naar een steriele weefselkweek kap en gehomogeniseerd in 5 ml PBS aangevuld met 2,5% FBS. Breng de homogenaat om een 15 ml Falcon buis.
- Centrifugeer het gehomogeniseerde milt weefselmonster op 1000 tpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C tot pellet de cellen.
- Schenk de bovenstaande vloeistof na het centrifugeren. Resuspendeer de cel pellet in 10 ml rode bloedcellen (RBC) lysis buffer bij kamertemperatuur gedurende 7 minuten om besmetting door de rode bloedcellen voorkomen.
- Centrifugeer steekproef bij 1000 rpm gedurende 10 minuten en decanteer de bovenstaande vloeistof en resuspendeer de cellen in 10 ml PBS met 2,5% FBS.
- Verwijder de 100 pi aliquot en tel de cellen op een verdunning van 1:1000 behulp van een standaard hemacytometer met behulp van trypan blauw aan een dode cellen te sluiten. Ongeveer 20-30 miljoen cellen kunnen worden verkregen per milt.
- Centrifugeer monster op 1000 tpm gedurende 10 minuten en decanteer het supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 0,5% BSA / PBS die 2 mM EDTA in een concentratie van 10 7 cellen per microliter 90.
- Add anti-CD43 antilichaam gecoate magnetische korrels naar de cellen om specifiek te binden non-B-cellen. Gebruik 10 pi kralen per 90 microliter (10 7 cellen). Meng goed en incuberen bij 4 ° C gedurende 20 minuten.
- Nadat de cellen zijn gelabeld, was ze door de toevoeging van 2,5% FBS / PBS naar de top van de buis. Centrifugeer steekproef bij 1000 rpm gedurende 10 minuten.
- Schenk de bovenstaande vloeistof. Resuspendeer de cellen in 0,1% BSA / PBS bij een concentratie van 10x10 7 cellen per ml.
- Monteer een magnetisch sorteren kolom op een magnetische scheider. Plaats een conische buis direct onder de kolom om de doorstroming te verzamelen en de kolom last met 3ml 0,5% BSA / PBS om te primeren en wassen.
- Zodra de wasvloeistof heeft door middel van gestroomd, te vervangen door een nieuwe collectie buis. Als het monster is minder dan 1 ml, pas monstervolume tot 1 ml met 0,5% BSA / PBS / EDTA en de belasting van het monster in de kolom. Belasting slechts 1 mL maximaal cellen per kolom en gebruik meerdere kolommen indien nodig.
- Laat de cellen om passief stroming door de kolom en de ongebonden cellen te verzamelen in de conische buis onder de kolom. Was de kolom 4 keer met 3 ml 0,5% BSA / PBS terwijl u de doorstroming te verzamelen.
- Verzamel alle doorstroming waarin CD43 negatieve rustende B-cellen zullen worden verrijkt. Gooi de kolom. Centrifuge flow-through bij 1000 rpm gedurende 10 minuten.
- Giet het supernatant en voeg 10 ml medium (15% FCS / + glutamine, Pen / Strep, niet-essentiële aminozuren, 50 uM Β-ME)
- Tel het aantal cellen en cultuur op 10 6 cellen per ml.
- Om de B-cel groei en proliferatie te stimuleren, aan te vullen het medium met recombinant IL-4 en anti-CD40 antilichaam zodanig dat de uiteindelijke concentraties zijn 20 ug / ml en 1 ug / ml, respectievelijk, en overdracht van de cellen om een cultuur kolf.
- Cultuur de cellen 's nachts. Tellen cellen en verdun tot 10 6 cellen per ml, het toevoegen van IL-4 en CD40 naargelang het geval.
- Cultuur cellen voor 72 uur voor virale infectie.
2. Transfectie van producerende cellen
Gebruik vastgestelde protocollen voor transfectie met behulp van kationische lipiden of calciumfosfaat. Transfecteren 10cm 3 platen per DNA-construct, met behulp van 100 ug plasmide DNA per plaat. We routinematig gebruik van calciumfosfaat transfectie methode 13, 14 en noteer een hoge virale titer bij aangevuld met chloroquine.
- Gebruik 60% -70% confluent Phoenix cellen als producerende cellen worden getransfecteerd. Op deze samenloop celgetal moet 5 miljoen cellen per 10 cm plaat.
- Een uur voorafgaand aan transfectie, vervang dan de media met verse complete media voor Phoenix celgroei.
- In een steriele eppendorpf buis, combineer 100 ug van verpakkingen bouwen DNA, 250 ul van 0,5 M CaCl 2, en pas het uiteindelijke volume tot 500 pL met steriel water
- Met behulp van een 1 ml pipet, krachtig mengen deze oplossing met 500 pL 2X HNP in een 15 ml polypropyleen buis
- Laat dit mengsel bij kamertemperatuur rust 8-10 minuten. Gedurende deze tijd een neerslag zal vormen.
- Voeg de transfectie mengsel druppelsgewijs naar de cellen, terwijl wervelende de middellange tot gelijkmatig te verdelen het mengsel door.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C gedurende 12 uur.
- 12 uur na de transfectie, vervang het medium met 8ml volledige B-cel groeimedium en de terugkeer van de cellen om de 37 ° C incubator.
3. Infectie van Gestimuleerd milt B-cellen
- Verwijder supernatant van Phoenix cellen 48hr post-Transfectie en passeren het supernatant door een 0,2 micron filter om elke cel vuil te verwijderen.
- Mix 3 mL van virus-bevattende supernatant met 3 ml van de pre-geactiveerde B-cellen (zoals in stap 1). Om de virale adsorptie te verbeteren om de cellen, voeg polybreen bij een uiteindelijke concentratie van 16 ug per ml.
- Infecteren van de cellen door centrifugeren bij 2500 rpm gedurende 90 minuten bij 30 ° C.
- Direct na de spin, incubeer nogmaals 48-72 uur bij 37 ° C te zorgen voor celgroei en proliferatie.
4. Flowcytometrie-analyse
- Met behulp van een flowcytometer, het analyseren van de cellen voor oppervlakte-expressie van de B220 en oppervlakte IgG1. De aanwezigheid van IgG1 op het oppervlak van de cellen geeft aan dat klasse switch recombinatie heeft plaatsgevonden als gevolg van de succesvolle redding via de retrovirale invulling van de AID-gen.
5. Representatieve resultaten
We hebben met succes redde de deficiëntie van het eiwit factor-activatie die geïnduceerd cytidinedeaminase (AID) van AID-deficiënte (AID-/ -) B-lymfocyten met behulp van retrovirale transductie. Kortom, we gegenereerde recombinante retrovirussen uiten muis AID (MAID) eiwit door het transfecteren Phoenix cellen met PMX-Maid-GFP 15-18. De geoogste virussen geïnfecteerd werden in de AID-deficiënte B-cellen verkregen van AID-deficiënte muizen in ex vivo klasse switch recombinatie (CSR) stimulatie voorwaarden 19. De geïnfecteerde B-cellen werden vervolgens geanalyseerd voor MVO te IgG1 na 72 uur in de cultuur met behulp van flowcytometrie-analyse. Figuur 2 toont de detectie van IgG1 op het oppervlak van B-cellen met AID, maar niet de lege bouwen, wat aangeeft dat MVO zich heeft voorgedaan als gevolg van de AID uitdrukking te redden.
Figuur 1: Schema van retrovirale verpakking binnen producerende cellen: Gene van belang, vertegenwoordigd door Ψ, werd gesubkloneerd in PMX-IRES-GFP, zoals eerder beschreven 15. Het plasmide werd getransfecteerd in een ecotropic virale verpakking cellijn kan produceren gag-pol en envelop eiwit (Phoenix, Orbigen), met behulp van calciumfosfaat methode 13, 14. Achtenveertig uur na transfectie, was supernatant met virale deeltjes geoogst voor de infectie in doel primaire B-cellen afkomstig van muizen.
Figuur 2: AID tekort B-cellen, gestimuleerd met anti-CD40 en IL-4 werden besmet met een retrovirus met PMX-Maid-GFP of een retrovirus uiten van GFP alleen. Het niveau van MVO om IgG1 werd geëvalueerd door FACS-analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Retrovirale transductie van milt B-cellen zoals hier beschreven en zoals afgebeeld in figuur 1 is een genetische benadering die nuttig is in de studie van de B-lymfocyten, omdat veel van de ontwikkeling gebeurtenissen in lymphopoesis worden bestuurd door transcriptionele regulatie 1, 2. In de latere stadia van de B-cel rijping, triggering via CD40L is essentieel voor de inductie van B-cel groei, toegang tot de celcyclus, en proliferatie 11, 20. Zoals weergegeven in figuur 2, kunnen B-cellen worden gestimuleerd in vitro met anti-CD40 en IL4 deze uitbarsting van proliferatie ondergaan, en retrovirale vectoren zijn nuttige instrumenten om over-express eiwitten die kunnen functioneren tijdens deze stadia van de B-cel ontwikkeling. In het voorbeeld getoond in Fig. 2, tonen we aan dat AID-deficiënte B-cellen die zijn niet in staat om CSR (hier om IgG1) ondergaan kan worden gered voor deze functie door retrovirally de introductie van de muis AID-gen. Deze aanpak stelt ons in staat om bij te houden voor GFP-positieve cellen (zie figuur 1) die hebben ondergaan MVO (IgG1 + GFP +).
Deze methode is voordelig dan de muis modellen in dat het kan in minder dan een week worden afgerond na de milt oogst in tegenstelling tot de tijdsinvestering om een transgene muis te creëren. De aard van de analyse kan worden afgestemd op toepassingen van de onderzoeker, hier hebben we gepresenteerd analyse van de klasse switch recombinatie door flow cytometrie als in figuur 2. Daarnaast is deze methode geschikt is voor een reeks van biochemische methoden volgende eiwit extractie uit de retrovirally-getransduceerde cellen 15, 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
CK wordt ondersteund door de Columbia University Graduate programma. UB is Fellow van de leukemie en lymfoom Society of America, de ontvanger van New Investigator Award van de Leukemie Research Foundation en wordt ondersteund door de Columbia University New Faculty start-up fondsen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FCS | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| RPMI | Invitrogen | 22400 | |
| PBS | Invitrogen | 20012 | |
| Red Blood Cell (RBC) lysis buffer | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| CD43 beads | Miltenyi Biotec | ||
| B Cell Complete Media | Various | Various Components | RPMI, 15% FCS, 1% Non-Essential Amino Acids, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50μM β-Mercapt–thanol |
| IL-4 | |||
| Anti-CD40 | BD Biosciences | 553787 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689 | |
| Chloroquine diphosphate salt | Sigma-Aldrich | C6628 | Used at 100mM |
| Ph–nix Eco cells (Murine) | Orbigen | RVC-10002 | |
| PE-Cy5-α-mouse-CD45R (B220) | eBioscience | 15-0452-81 | |
| PE-α-mouse-IgG1 | BD Biosciences | A85-1 |
References
- Bartholdy, B., Matthias, P. Transcriptional control of B cell development and function. Gene. 327, 1-23 (2004).
- Henderson, A., Calame, K. Transcriptional regulation during B cell development. Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).
- Graf, T. Differentiation plasticity of hematopoietic cells. Blood. 99, 3089-30101 (2002).
- Xiao, C., Rajewsky, K. MicroRNA control in the immune system: basic principles. Cell. 136, 26-36 (2009).
- Waterston, R. H. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome. Nature. 420, 520-562 (2002).
- Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. Introduction to Genetic Analysis. , W. H. Freeman. New York. (2000).
- Gondo, Y. Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics. BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).
- Plachy, J. Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas. J Virol. 84, 4204-4211 (2010).
- Felice, B. Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome. PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).
- Karavanas, G. Cell targeting by murine retroviral vectors. Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).
- Noelle, R. J. A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).
- Muramatsu, M. Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell. 102, 553-563 (2000).
- Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions. J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Fagarasan, S. In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria. Nature. 413, 639-6343 (2001).
- Basu, U. The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation. Nature. 438, 508-5011 (2005).
- McBride, K. M. Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation. J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).
- Barreto, V. M. AID from bony fish catalyzes class switch recombination. J Exp Med. 202, 733-738 (2005).
- Delphin, S., Stavnezer, J. Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter. Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).
- Castigli, E. CD40 expression and function in murine B cell ontogeny. Int Immunol. 8, 405-411 (1996).
- Ballantyne, J. Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination. J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).
