Summary
توضح هذه المقالة ثقافة شرائح الأنسجة المريضة للدراسات توصيل الجينات وتحليل لاحقة في التعبير الجيني باستخدام التصوير IVIS تلألؤ بيولوجي.
Abstract
هذا الفيديو يصف استخدام أنسجة المريض كنموذج فيفو السابقين لدراسة توصيل الجينات. هو شرائح طازجة الأنسجة المريضة حصلت في وقت الجراحة ، والاحتفاظ بها في الثقافة. نموذج الجسم الحي السابقين نظام يسمح للالتسليم المادي للجينات في أنسجة المريض سليمة ويتم تحليل التعبير الجيني عن طريق التصوير تلألؤ بيولوجي باستخدام نظام الكشف IVIS. نظام الكشف bioluminescent يوضح الكمي سريعة ودقيقة في التعبير الجيني داخل شرائح فردية من دون الحاجة للتضحية الأنسجة. ويمكن استخدام هذا النظام شريحة زراعة الأنسجة في مجموعة متنوعة من أنواع الأنسجة بما في ذلك الأنسجة الطبيعية والخبيثة ، ويسمح لنا لدراسة الآثار المترتبة على الطبيعة غير المتجانسة للأنسجة سليمة وعلى درجة عالية من التباين بين المرضى الفردية. ويمكن استخدام هذا النظام النموذجي في بعض الحالات كبديل للنماذج حيوانية واسطة قبل السريرية والتكميلية قبل دخول التجارب السريرية.
Protocol
إعداد وسائل الإعلام والكواشف
- المضادات الحيوية الحل
الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) مع 200 U / البنسلين مل و 200 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، 5 ميكروغرام / مل fungizone - جمع ومعالجة المتوسطة
Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) مع 200 U / البنسلين مل و 200 ميكروغرام / مل الستربتوميسين ، 5 ميكروغرام / مل fungizone - مستنبت
متوسطة تحتوي على جمع 10 ٪ الحرارة المعطل مصل بقري جنيني
أولا جمع وتخزين الأنسجة
تم الحصول على موافقة لجمع الأنسجة المريضة من لجنة أخلاقيات البحوث السريرية للمستشفيات وتدريس كورك تم الحصول على الموافقة المستنيرة من المريض قبل يوم من الجراحة. تم الحصول على أنسجة الكبد من المرضى الذين يخضعون لاستئصال الكبد الجزئي لمرض خبيث.
- يتم الحصول على أنسجة المريض الطازجة في وقت استئصال الجراحي.
- يتم تخزين الانسجة في وسائل الإعلام في جمع 4 درجات مئوية (يمكن تخزين مبردة الأنسجة لمدة تصل إلى 12 ساعة من دون خسارة كبيرة في قدرتها على البقاء ، ولكن من المستحسن معالجة فورية).
II. نسيج إعداد شريحة والثقافة
أجري تشريح باستخدام vibratome (لايكا ، ألمانيا). تم استخدام نظام تشريح الأنسجة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أنجز إعداد الأنسجة تحت غطاء شريحة باستخدام أدوات معقمة تنظيفها مع 70 ٪ 2 بروبانول. تم تعيين سمك شريحة ميكرون في 2000 وخفض استخدام شفرة الترددية في 22-26 دورة في الدقيقة.
- يغسل النسيج في محلول مضاد حيوي ثلاث مرات.
- ويرد الأنسجة لمرحلة تصاعد استخدام غير سامة لاصقة (Dermabond).
- تم تعيين سمك شريحة ويتحقق تشريح 22-26 في دورة في الدقيقة.
- وحافظت الشرائح في مستنبت في أطباق ثقافة 6 - جيدا (شريحة واحدة لكل بئر) في 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 في بيئة مرطب.
III. إيصال الجين إلى شرائح الأنسجة
- وقبل شرائح المحتضنة في 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة قبل العلاج.
- يتم استبدال مستنبت المتوسطة مع العلاج.
- تحقن مباشرة مع شرائح ناقلات فيروسية (25 ميكرولتر من الجسيمات الفيروسية Ad5.CMVluc [1x10 9]). بدلا من ذلك ، قد يتم إضافة جزيئات إلى المتوسط ، للتسريب السلبي.
- بعد ساعتين من الحضانة ، إضافة إلى المصل المتوسط.
رابعا. تحليل التعبير الجيني عن طريق التحليل bioluminescent
- يتم حقن شرائح مع 100 ميكرولتر من الركيزة luciferin (3 ملغ / مل).
- يوضع طبق بشكل جيد لمدة 6 الثقافة على خشبة المسرح والمحتضنة لمدة 10 دقيقة.
- يتم تصوير شرائح لمدة 5 دقائق على حساسية عالية (الشكل 1).
خامسا نتائج الممثل
الشكل 1. التصوير Bioluminescent من شرائح الكبد المريض باستخدام نظام IVIS الكشف.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفنا مريض فيفو السابقين نسيج الثقافة والأسلوب bioluminescent نظام كشف لتقييم إيصال الجين غير ثابت داخل الأنسجة البشرية. الأسلوب يوفر وسيلة بسيطة وقابلة للتكرار من شرائح الأنسجة زراعة. انها لديها امكانات كبيرة لأنها تتيح دراسة توصيل الجينات إلى الخلايا البشرية السليمة ، وتحليل توصيل الجينات في مجموعة متنوعة من الانسجة البشرية بما في ذلك الأنسجة الخبيثة ويمكن أن توفر معلومات مهمة بشأن الآثار المترتبة على درجة عالية من التباين بين المرضى الفردية مع الاحترام لامتصاص الجين. قد أنواع السرطان المختلفة لها تأثيرات متفاوتة على فعالية للمراحل المختلفة للتعبير التحوير ناجحة في الخلايا ، والتي تنطوي على امتصاص الحمض النووي والنسخ اللاحقة والترجمة. وترد هذه الخطوات في الرسوم المتحركة الفيديو ، وذلك باستخدام ناقل فيروسي كمثال على ذلك. نظام الكشف bioluminescent يوضح الكمي سريعة ودقيقة في التعبير الجيني داخل شرائح فردية من دون الحاجة للتضحية الأنسجة. لناقلات النسخ غير كفء ، مثل العاملين في هذه الدراسة ، التلألؤ وهناك علاقة مباشرة في التعبير الجيني من قبل خلايا.
وهذا النظام النموذجي توفر معلومات قيمة بشأن توصيل الجينات إلى النسيج المريض قبل دخول التجارب السريرية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من خلال صندوق كورك جنوب مستشفى جامعة فيكتوريا في مستشفى الثدي ، وجمعية السرطان الأيرلندية (CRI07TAN) ومركز أبحاث السرطان كورك. وكان النسخ المتماثل غير كفء المؤتلف اتش 5 الجسيمات تحت سيطرة الترانسكربتي من المروج CMV هدية عينية من البروفسور أندرو بيكر ، من جامعة غلاسكو.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
- Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
- Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
- Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).
