Summary
В этой статье описывается культура пациента ломтиками ткани для доставки генов исследования и последующего анализа экспрессии генов использованием ИВИС биолюминесценции изображений.
Abstract
Это видео описывает использование тканей пациента, как бывшие модели естественных условиях для изучения доставки генов. Свежий ткани пациента получены во время операции нарезанный и поддерживаться в культуре. Бывшие модели системы естественных условиях позволяет физическая доставка генов в неповрежденной ткани пациента и экспрессии генов анализируется биолюминесценции визуализации с использованием системы ИВИС обнаружения. Биолюминесцентного системы обнаружения демонстрирует быстрое и точное количественное экспрессии генов в отдельных ломтиков без необходимости ткани жертвы. Эта культура срез ткани система может быть использована в самых разных типов тканей, включая нормальных и злокачественных тканей и позволяет изучать последствия гетерогенный характер неповрежденной ткани и высокая степень изменчивости между отдельными пациентами. Эта модель система может быть использована в определенных ситуациях в качестве альтернативы животных моделях и в качестве дополнительного доклинических режиме до входа в клинических испытаниях.
Protocol
Подготовка медиа и реагенты
- Раствором антибиотика
Фосфатным буферным раствором (PBS) с 200 ед / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл Fungizone - Сбор и очистка среды
Дульбеко изменение орел среды (DMEM) с 200 ед / мл пенициллина, 200 мкг / мл стрептомицина, 5 мкг / мл Fungizone - Культура среда
Коллекция среде, содержащей 10% тепла инактивированной эмбриональной телячьей сыворотки
И. коллекции тканей и хранения
Утверждение для пациента коллекции тканей была получена из Клинические исследования этическим комитетом больницы Корк Обучение и информированное согласие было получено от пациентов за день до операции. Ткани печени была получена из пациентов, перенесших частичную резекцию печени злокачественных заболеваний.
- Свежий ткани пациента получается во время хирургической резекции.
- Ткань хранится в коллекции средств массовой информации при 4 ° С (ткани, может храниться в холодильнике до 12 ч без значительной потери жизнеспособности, однако немедленной обработки рекомендуется).
II. Ткань подготовки ломтик и культуры
Нарезки проводили с использованием vibratome (Leica, Германия). Ткани нарезки система была использована в соответствии с инструкциями производителя. Подготовка ткани срез был выполнен под капотом стерильной используя инструменты очищаются 70% 2-пропанола. Толщина среза устанавливается в размере 2000 микрон и обработке с использованием поршневых лезвием на 22-26 оборотов в минуту.
- Ткань промывают раствором антибиотика в три раза.
- Ткань крепится к стадии монтажа использованием нетоксичных клей (Dermabond).
- Толщина среза установлен и нарезая достигается при 22-26 оборотов в минуту.
- Фрагменты сохраняются в культуральной среде в 6-и культуре блюд (один ломтик на лунку) при 37 ° C с 5% СО 2 во влажной среде.
III. Гена доставки срезы тканей
- Ломтики предварительно инкубировали при 37 ° С в течение 2 ч до начала лечения.
- Культура среду заменяют лечение среды.
- Ломтики непосредственно вводили вирусный вектор (25 мкл вирусных частиц Ad5.CMVluc [1x10 9]). Кроме того, частицы могут быть добавлены к среде, для пассивных инфузии.
- После двух часов инкубации сыворотки добавляется в среду.
IV. Анализ экспрессии генов с биолюминесцентного анализа
- Ломтики вводят 100 мкл люциферин подложки (3 мг / мл).
- 6-а блюдо культуры находится на сцене, и выдерживают в течение 10 мин.
- Ломтики изображаются в течение 5 мин при высокой чувствительности (рис. 1).
Результаты В. представитель
Рисунок 1. Биолюминесцентный изображений пациента ломтика печени использованием ИВИС системы обнаружения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Мы описываем бывших естественных тканей пациента методом культуры и биолюминесцентного системы обнаружения для оценки доставки генов в нефиксированной ткани человека. Метод предлагает простые и воспроизводимые способ ломтиками культивирования тканей. Он имеет значительный потенциал, так как позволяет изучение доставки генов в нетронутой человеческой ткани, анализ доставки генов в различных тканях человека, в том числе злокачественные ткани и могут предоставить важную информацию о влиянии высокой степенью изменчивости между отдельными пациентами в отношении к генной поглощения. Различные виды рака могут по-разному влияет на эффективность различных этапах успешного выражения трансгенов в клетках, связанных поглощения ДНК и последующей транскрипции и трансляции. Эти шаги, изложенные в видео-анимации с помощью вирусного вектора в качестве примера. Биолюминесцентного системы обнаружения демонстрирует быстрое и точное количественное экспрессии генов в отдельных ломтиков без необходимости ткани жертвы. Для репликации некомпетентных векторов, например, занятых в этом исследовании, свечения напрямую связано с генной экспрессии клетками.
Эта модель системы позволит получить ценную информацию относительно доставки генов в ткани пациента перед входом клинических испытаний.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась через Корк Южной больнице Виктория университетской больницы груди фонда, ирландского общества рака (CRI07TAN) и Научно-исследовательского онкологического центра Корка. Репликация некомпетентных рекомбинантный аденовирус 5 частиц под транскрипционным контролем промотора CMV был своего рода подарок от профессора Эндрю Бейкер, Университет Глазго.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6429 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Firefly Luciferin | Biosynth International, Inc | ||
| Dermabond | Johnson & Johnson | ||
| Vibrotome | Leica Microsystems | VT 1000 A |
References
- van de Bovenkamp, M., Groothuis, G. M., Draaisma, A. L., Merema, M. T., Bezuijen, J. I., van Gils, M. J. Precision-cut liver slices as a new model to study toxicity-induced hepatic stellate cell activation in a physiologic milieu. Toxicol Sci. 85, 632-638 (2005).
- Speirs, V., Green, A. R., Walton, D. S., Kerin, M. J., Fox, J. N., Carleton, P. J. Short-term primary culture of epithelial cells derived from human breast tumours. Br J Cancer. 78, 1421-1429 (1998).
- Kirby, T. O., Rivera, A., Rein, D., Wang, M., Ulasov, I., Breidenbach, M. A novel ex vivo model system for evaluation of conditionally replicative adenoviruses therapeutic efficacy and toxicity. Clin Cancer Res. 10, 8697-8703 (2004).
- Josserand, V., Texier-Nogues, I., Huber, P., Favrot, M. C., Coll, J. L. Non-invasive in vivo optical imaging of the lacZ and luc gene expression in mice. Gene Ther. 14, 1587-1593 (2007).
