Summary

אקס הרחבה vivo של גידול תאים T-reactive באמצעות 1/Ionomycin Bryostatin ואת גמא נפוצים שרשרת גיבוש ציטוקינים

Published: January 14, 2011
doi:

Summary

פרוטוקול יעיל עבור<em> לשעבר vivo</em> התפשטות של הגידול ותאי T-reactive מן הגידול ניקוז בלוטות הלימפה או אחרות ברקמות הלימפה משני נושאות גידולים המארחים מתואר. פרוטוקול זה מרחיב סלקטיבי גידולים ספציפיים בתאי T לשימוש חיסוני המאמצת של סרטן השד.

Abstract

נמסר כי חולי סרטן השד יש קיימים התגובות החיסוניות נגד גידולים 1,2 שלהם. עם זאת, התגובה החיסונית כאלה אינן מספקות הגנה מלאה מפני התפתחות או הישנות סרטן השד. כדי להתגבר על הבעיה על ידי הגדלת תדירות הגידול-reactive בתאי T, חיסוני המאמצת הועסק. מגוון של פרוטוקולי שימשו להרחבת גידול ספציפי בתאי T. פרוטוקולים אלה, לעומת זאת, מוגבלים לשימוש vivo אנטיגנים סרטניים לשעבר להפעלת אנטיגן ספציפי בתאי T. ממש לאחרונה, נפוץ שרשרת גאמא ציטוקינים כגון IL-2, IL-7, IL-15, IL-21 שימשו לבד או בשילוב להגברת אנטי הגידול התגובה החיסונית 3. עם זאת, לא ברור מה ניסוח יעבוד בצורה הטובה ביותר להרחבת הגידול ותאי T-reactive. כאן אנו מציגים פרוטוקול להפעלת סלקטיבית והרחבת הגידול ותאי T-reactive ממודל FVBN202 עכבר מהונדס של סרטן שד חיובי HER-2/neu לשימוש בטיפול T המאמצת התא של סרטן השד. הפרוטוקול כולל הפעלה של תאים T עם bryostatin-1/ionomycin (B / I) IL-2 בהעדר אנטיגנים סרטניים במשך 16 שעות. B / הפעלה אני מחקה אותות תאיים כי התוצאה הפעלת תא T על ידי הגדלת הפעילות חלבון kinase C, סידן תוך תאי, בהתאמה 4. פרוטוקול זה במיוחד הגידול מפעיל ספציפי בתאי T תוך הרג ותאי T לא רלוונטי. B / אני המופעל בתאי T הם מתורבתים עם IL-7 ו – IL-15 במשך 24 שעות ו פעמו אז עם IL-2. לאחר 24 שעות, ותאי T נשטפים, מפוצל, ותרבותיים עם IL-7 + IL-15 במשך 4 ימים נוספים. יעילות הגידול סגוליות ואנטי גידול של ex vivo תאים מורחבת T נקבע.

Protocol

1. בידוד של לימפוציטים 5 בודד הגידול ניקוז בלוטות הלימפה או spleens מן הגידול נושאות FVBN202 העכברים הטרנסגניים ולהכין ההשעיה תא יחיד קר כקרח RPMI1640 בתוספת 10% FBS. B / אני ההפעלה של 50 מ"ל פוליפרופילן תוצאות צינורות חרוטי בת…

Discussion

הרחבת סלקטיבי של גידולים בתאי T-reactive עם פונקציה אנטי הגידול מפעיל יכולה להיות מושגת על ידי שימוש בפרוטוקול המוצע B / אני הפעלה והרחבה vivo לשעבר עם שרשרת גאמא ציטוקינים IL-2, IL-7 ו IL-15. בעוד IL-2 הוא תא T גורם הצמיחה שיכול לתמוך הבידול וההתרחבות של אנטיגן ספציפי בתאי T, IL-7 י?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי NIH R01 CA104757 גרנט (MH Manjili). בהכרת תודה אנו מכירים את התמיכה של VCU מאסי לחקר הסרטן וקרן העמים לחקר הסרטן.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bryostatin 1   Sigma B7431-10ug  
Ionomycin   Calbiochem 407950  
Mouse IL-7   PeproTech 217-17  
Mouse IL-15   PeproTech 210-15  
Human IL-2   PeproTech 200-02  
RPMI1640   Invitrogen 11875  
FBS   Gemini 100-106  
Penicillin/Streptomycin   Cellgro 30-002-CI  
L- glutamine   Invitrogen 25030081  
β- mercaptoethanol   Sigma M7522  
anti-CD16/32 antibody   Biolegend 101302  
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit   BD Pharmingen 556547  
FITC-CD4   Biolegend 100406  
PE-CD8   Biolegend 100708  
anti-c-Erb2/c–Neu   Calbiochem OP16  
PE- anti mouse IgG   Biolegend 405307  
formaldehyde   Polysciences 04018  
Hemocytometer   Hycor 87144  
Light microscope   VWR V200073  
Mouse IFN-γ ELISA set   BD Pharmingen 555138  
Cell culture flasks   Greiner 658175  

References

  1. Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
  2. Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
  3. Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
  4. Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
  5. Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
  6. Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
  7. Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
  8. Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
  9. Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
  10. Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
  11. Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

View Video