Summary
Een efficiënte protocol voor de
Abstract
Er werd gemeld dat borstkanker bij pre-bestaande immuunrespons tegen hun tumoren 1,2 te hebben. Echter, een dergelijke immuunreacties geen volledige bescherming bieden tegen de ontwikkeling of herhaling van borstkanker. Om dit probleem te verhelpen door het verhogen van de frequentie van de tumor-reactieve T-cellen, is adoptieve immunotherapie in dienst. Een verscheidenheid aan protocollen die zijn gebruikt voor de uitbreiding van tumor-specifieke T-cellen. Deze protocollen zijn echter beperkt tot het gebruik van tumor antigenen ex vivo voor de activatie van antigeen-specifieke T-cellen. Zeer recent hebben gemeenschappelijke gamma-keten cytokinen zoals IL-2, IL-7, IL-15 en IL-21 is alleen of in combinatie worden gebruikt voor de versterking van de anti-tumor immuunrespons 3. Het is echter niet duidelijk wat formulering zou het beste werken voor de uitbreiding van de tumor-reactieve T-cellen. Hier presenteren wij een protocol voor de selectieve activering en uitbreiding van tumor-reactieve T-cellen uit de FVBN202 transgene muis-model van HER-2/neu positief borstcarcinoom voor gebruik in de adoptieve T cel-therapie van borstkanker. Het protocol bevat activatie van T-cellen met bryostatin-1/ionomycin (B / I) en IL-2 in de afwezigheid van tumor antigenen gedurende 16 uur. B / I activering nabootst intracellulaire signalen die resulteren in een T-cel activatie door het verhogen van proteïne kinase C-activiteit en intracellulair calcium, respectievelijk 4. Dit protocol activeert specifiek tumor-specifieke T-cellen, terwijl het doden van niet ter zake T-cellen. De B / I-geactiveerde T-cellen worden gekweekt met IL-7 en IL-15 voor 24 uur en dan gepulst met IL-2. Na 24 uur, T-cellen worden gewassen, splitsen en gekweekt met IL-7 + IL-15 voor extra 4 dagen. Tumor-specificiteit en anti-tumor effectiviteit van de ex vivo geëxpandeerde T-cellen wordt bepaald.
Protocol
1. Isolatie van Lymfocyten 5
- Isoleer tumor-drainerende lymfeklieren of milt van tumor-dragende FVBN202 transgene muizen en voor te bereiden enkele celsuspensie in ijskoud RPMI1640 aangevuld met 10% FBS. B / I activering in 50 ml polypropyleen conische buizen resulteert in een grotere T-cel-opbrengst in vergelijking met polystyreen buizen. Ketamine en xylazine worden geïnjecteerd ip voor anesthesie. Cervicale dislocatie wordt gebruikt als een methode van euthanasie.
- Cultuur van de cellen (10 6 cellen / ml) in volledig medium dat 15% FBS met bryostatin-1 (5 nM) en ionomycine (1 uM), samen met 80 U / ml IL-2 (Peprotech) voor 16 uur
- Was de cellen drie keer met warm medium (37 ° C) en cultuur bij 10 6 cellen / ml in compleet medium met IL-7 (10 ng / ml) en IL-15 (10 ng / mL) (Peprotech) voor 24 uur .
- Puls van de cellen met IL-2 (40 U / ml) gedurende 24 uur
- Splitsen van de cellen en de cultuur hen met IL-7 en IL-15 (10 ng / mL) voor 4 dagen. Verandering medium en splitsen de cellen als dat nodig is om de 2 dagen.
2. Bepaal Vouw Uitbreiding van T-cellen door de cel-tellingen en flowcytometrie-analyse 5
- Celtellingen door lichtmicroscopie
- Bereid juiste cel verdunning (1:100) in trypan blauw en voeg enkele uL op hemocytometer
- Count 9 pleinen en het vaststellen van totaal aantal cellen door deling van cellen telt het aantal kamers vermenigvuldigd met de verdunningsfactor. De resultaten zullen presenteren aantal x 10 4 cellen / ml.
- Te bepalen deel van de CD8 + en CD4 + T-cellen in de uitgebreide cellen door flowcytometrie
- Blokkeer niet-specifieke binding van antistoffen tegen Fc-receptoren door het kweken van de cellen met anti-CD16/CD32 antilichaam (Biolegend) gedurende 20 min op ijs en spoel daarna de cellen twee keer met 2 ml ijskoud PBS aangevuld met 1% natriumazide .
- Vlekken op de cellen door het kweken met FITC-CD4-en CD8-PE-antilichamen gedurende 20 min op ijs en spoel daarna de cellen twee keer met 2 ml ijskoud PBS aangevuld met 1% FBS en 0,1% natriumazide.
- Fixeer de cellen met 1% paraformaldehyde en lopen monsters op een Beckman Coulter FC 500 en analyseren met behulp van Summit versie 4.3 software.
3. Bepaal Tumor-specifieke karakter van de ex vivo Expanded T-cellen
- Cultuur van de ex vivo lymfocyten in compleet medium uitgebreid op een 10:01 verhouding met bestraalde neu positieve MMC tumorcellen (15.000 rad) gedurende 24 uur 5
- Oogst supernatants en bewaar bij -80 ° C tot gebruik. 5,6
- IFN-γ te detecteren met behulp van een IFN-γ muis ELISA Set (BD Pharmingen) volgens protocol van de fabrikant. 5,6
4. Bepaal Anti-tumor Functie van de ex vivo Expanded T-cellen 5,6
- Incubeer de T-cellen met tumorcellen in een 10:01 effector: doel ratio's voor 48 uur in compleet medium op 3 ml compleet medium (RPMI-1640 aangevuld met 100 E / ml penicilline, 100μg / ml streptomycine, 10% FBS, glutamine en β - mercaptoethanol) en 20U / ml IL-2 (Peprotech) in zes goed cultuur gerechten 37 ° C / 5% CO 2.
- Voer drie kleuren antilichaam kleuring voor neu (anti-c-Erb2/c-neu, kloon-4, Calbiochem), gevolgd door PE-anti-muis IgG, Annexine V-FITC en propidiumjodide (PI) volgens protocol van de fabrikant (BD Pharmingen)
- Gate op neu positieve tumorcellen en analyseren van levensvatbaarheid (Annexine V-/PI-) van de tumorcellen
5. Muis model van de Borstkanker
FVBN202 transgene vrouwelijke muizen (Charles River Laboratories) kan worden gebruikt voor de bron van tumor-reactieve T-cellen. Deze muizen overexpressie van een niet-geactiveerde rat neu transgen onder de regulatie van MMTV promotor en als gevolg daarvan de ontwikkeling van spontane mammacarcinoom tussen 4-10 maanden leeftijd van 7. Deze muizen ontwikkelen premaligne hyperplasie borstklieren vergelijkbaar met ductaal carcinoma in situ (DCIS) voorafgaand aan de ontwikkeling van spontane carcinoma8. Spontane tumor-dragende muizen worden gebruikt als donoren van T-cellen.
6. Representatieve resultaten:
Activatie van T-cellen met B / I gedurende 16 uur resulteert in het doden van naïeve T-cellen die niet zijn gesensibiliseerd met de tumor in vivo. Na het B / I selectiviteit van tumor-reactieve T-cellen ze tot 2,8-voudig uit te breiden in een 6-daagse cultuur met de gamma-keten cytokines (figuur 1). Zowel de CD8 + en CD4 + T-cellen zijn even uitgebreid met de gamma-keten cytokines (figuur 2). De ex vivo-geëxpandeerde T-cellen vertonen een hoge responsiviteit ten opzichte van de tumoren die donor muizen werden gesensibiliseerd om, zoals geëvalueerd door de productie van IFN-γ in de aanwezigheid van neu positieve muis mammacarcinoom (MMC) tumorcellen (figuur 3). De ex vivo geëxpandeerde T-cellen kan induceren apoptose in de neu positieve MMC tumor cells zodanig dat levensvatbaarheid van de tumorcellen daalt van 92% tot 61% binnen 48 uur (figuur 4).
Figuur 1. Fold uitbreiding van de lymfocyten op verschillende tijdstippen na B / I activering (dag 1) en ex vivo expansie met de gamma-keten cytokines (dag 3, 5 en 7)
Figuur 2. Totaal percentage van CD4 + en CD8 + T-cellen voor en na een 7-daagse uitbreiding met de gamma-keten cytokines.
Figuur 3. Tumor-IFN-γ gestimuleerd productie door T-cellen geïsoleerd uit tumor-dragende muizen voorafgaand aan en na een 7-daagse uitbreiding met de gamma-keten cytokines, met behulp van IFN-γ ELISA
Figuur 4. Cytotoxische functie van de ex vivo uitgebreid T-cellen met de gamma-keten cytokines tegen neu positieve muis mammacarcinoom (MMC) tumorcellen
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selectieve uitbreiding van tumor-reactieve T-cellen met effector anti-tumor-functie kan worden bereikt door het voorgestelde protocol met behulp van B / I-activering en ex vivo expansie met de gamma-keten cytokines IL-2, IL-7 en IL-15. Terwijl de IL-2 is een T-cel groeifactor die de differentiatie en uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen kan ondersteunen, kan IL-7 remmen apoptose van T-cellen en ondersteuning van hun levensvatbaarheid tijdens de expansie. IL-15 kan ondersteunen geheugen T-cellen die belangrijk zijn voor het genereren van langdurige anti-tumor responsen op adoptieve T cel-therapie 9-11. Het veranderen van de volgorde en de combinatie van deze cytokines invloed kunnen zijn op de differentiatie van de uitgebreide T-cellen die op hun beurt kunnen verbeteren of vermindering van hun anti-tumor werking 12. De voorgestelde protocol zal niet vereist dat de identificatie van tumor antigenen. Selectieve uitbreiding van tumor-reactieve T-cellen resulteert in de productie van grote aantallen van anti-tumor T-cellen die kunnen worden gebruikt voor de adoptieve T cel-therapie van kankerpatiënten. We hebben eerder aangetoond dat de ex vivo geëxpandeerde T cellen beschermde dieren tegen borstkanker volgende adoptieve T cel-therapie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili). Wij dankbaar de steun van VCU Massey Cancer Center en de Commonwealth Foundation for Cancer Research.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bryostatin 1 | Sigma-Aldrich | B7431-10ug | |
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | |
| Mouse IL-7 | PeproTech Inc | 217-17 | |
| Mouse IL-15 | PeproTech Inc | 210-15 | |
| Human IL-2 | PeproTech Inc | 200-02 | |
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | |
| FBS | Gemini Bio Products | 100-106 | |
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | |
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | |
| β- mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | |
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Biosciences | 556547 | |
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | |
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | |
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | |
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | |
| formaldehyde | Polysciences, Inc. | 04018 | |
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | |
| Light microscope | VWR international | V200073 | |
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Biosciences | 555138 | |
| Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 |
References
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
