Summary

Espansione ex vivo di tumore cellule T reattive per mezzo di 1/Ionomycin Bryostatin e il Comune catena gamma Citochine Formulazione

Published: January 14, 2011
doi:

Summary

Un protocollo efficiente per la<em> Ex vivo</emEspansione> di tumore cellule T reattive da tumore-drenante linfonodi o altri tessuti linfatici secondari del tumore-cuscinetto ospita è descritto. Questo protocollo si espande selettivamente tumore-specifiche cellule T per l'uso in immunoterapia adottiva di cancro al seno.

Abstract

E 'stato riferito che i pazienti con cancro al seno hanno una risposta immunitaria preesistente contro i 1,2 tumori. Tuttavia, tali risposte immunitarie non riescono a fornire protezione completa contro lo sviluppo o la recidiva di cancro al seno. Per superare questo problema aumentando la frequenza del tumore cellule T reattive, immunoterapia adottiva è stato impiegato. Una varietà di protocolli sono stati utilizzati per l'espansione del tumore-specifica delle cellule T. Questi protocolli, tuttavia, sono limitati per l'utilizzo del tumore ex vivo antigeni per l'attivazione di antigene-specifiche cellule T. Molto recentemente, comune citochine gamma catena quali IL-2, IL-7, IL-15 e IL-21 sono stati utilizzati da soli o in combinazione per il miglioramento della risposta immunitaria anti-tumorale 3. Tuttavia, non è chiaro quale formulazione avrebbe funzionato meglio per l'espansione del tumore cellule T reattive. Qui vi presentiamo un protocollo per l'attivazione selettiva e l'espansione delle cellule T tumorali-reattiva dal modello FVBN202 topo transgenico di carcinoma mammario HER-2/neu positivo per l'uso in terapia cellulare adottiva T di cancro al seno. Il protocollo prevede l'attivazione di cellule T con bryostatin-1/ionomycin (B / I) e di IL-2, in assenza di antigeni tumorali per 16 ore. B / I di attivazione imita segnali intracellulari che comportano l'attivazione delle cellule T, aumentando l'attività della proteina chinasi C e calcio intracellulare, rispettivamente 4. Questo protocollo attiva specificamente tumore-specifica delle cellule T, mentre l'uccisione delle cellule T irrilevante. Il B / I-cellule T attivate sono in coltura con IL-7 e IL-15 per 24 ore e poi pulsato con IL-2. Dopo 24 ore, le cellule T sono lavati, divisi, e la coltura con IL-7 + IL-15 per ulteriori 4 giorni. Tumorali specificità e l'efficacia anti-tumorale della ex vivo delle cellule T espanse è determinata.

Protocol

1. Isolamento dei linfociti 5 Isolare tumore-drenante linfonodi o milza di portatori di tumore FVBN202 topi transgenici e preparare sospensione singola cellula ghiacciato RPMI1640 supplementato con 10% FBS. B / I di attivazione in 50 ml in polipropilene risultati tubi conici in una maggiore produzione di cellule T rispetto ai tubi in polistirolo. Ketamina e xilazina vengono iniettati ip per l'anestesia. Dislocazione cervicale è utilizzato come metodo di eutanasia. Coltura delle cellu…

Discussion

Espansione selettiva del tumore-reattiva cellule T effettrici con funzione anti-tumorale può essere ottenuto utilizzando il protocollo proposto B / I di attivazione ed espansione ex vivo con citochine catena gamma di IL-2, IL-7 e IL-15. Mentre IL-2 è un fattore di crescita delle cellule T in grado di supportare la differenziazione e l'espansione di antigene-specifiche cellule T, IL-7 in grado di inibire l'apoptosi delle cellule T e sostenere la loro vitalità durante l'espansione. IL-15 può suppo…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto da NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili). Noi riconosciamo con gratitudine il sostegno della VCU Massey Cancer Center e della Fondazione del Commonwealth per la Ricerca sul Cancro.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bryostatin 1   Sigma B7431-10ug  
Ionomycin   Calbiochem 407950  
Mouse IL-7   PeproTech 217-17  
Mouse IL-15   PeproTech 210-15  
Human IL-2   PeproTech 200-02  
RPMI1640   Invitrogen 11875  
FBS   Gemini 100-106  
Penicillin/Streptomycin   Cellgro 30-002-CI  
L- glutamine   Invitrogen 25030081  
β- mercaptoethanol   Sigma M7522  
anti-CD16/32 antibody   Biolegend 101302  
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit   BD Pharmingen 556547  
FITC-CD4   Biolegend 100406  
PE-CD8   Biolegend 100708  
anti-c-Erb2/c–Neu   Calbiochem OP16  
PE- anti mouse IgG   Biolegend 405307  
formaldehyde   Polysciences 04018  
Hemocytometer   Hycor 87144  
Light microscope   VWR V200073  
Mouse IFN-γ ELISA set   BD Pharmingen 555138  
Cell culture flasks   Greiner 658175  

References

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Cite This Article
Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

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