Summary

Ex vivo Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen mittels Bryostatin 1/Ionomycin und der Gemeinsamen gamma-Kette Zytokine Formulation

Published: January 14, 2011
doi:

Summary

Ein effizientes Protokoll für die<em> Ex vivo</em> Ausbau der Tumor-reaktiven T-Zellen aus Tumor-drainierenden Lymphknoten oder anderen sekundären lymphatischen Gewebe des tumortragenden Gastgeber beschrieben. Dieses Protokoll selektiv erweitert tumor-spezifische T-Zellen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapie von Brustkrebs.

Abstract

Es wurde berichtet, dass Brustkrebs-Patientinnen bereits bestehende Immunantworten gegen ihren Tumoren 1,2 haben. Allerdings scheitern solche Immunantwort auf einen vollständigen Schutz gegen die Entwicklung oder Wiederauftreten von Brustkrebs bieten. Zur Lösung dieses Problems durch die Erhöhung der Häufigkeit von Tumor-reaktiven T-Zellen hat adoptiven Immuntherapie eingesetzt. Eine Vielzahl von Protokollen für die Expansion von Tumor-spezifischen T-Zellen verwendet wurden. Diese Protokolle sind jedoch die Verwendung von Tumor-Antigenen ex vivo für die Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Zellen beschränkt. Vor kurzem haben gemeinsame gamma-Kette Zytokine wie IL-2, IL-7, IL-15 und IL-21 wurden allein oder in Kombination zur Verbesserung der Anti-Tumor-Immunantwort 3 verwendet. Es ist jedoch nicht klar, was Formulierung am besten für die Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die selektive Aktivierung und Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen aus dem FVBN202 transgenen Mausmodell der HER-2/neu positiven Mammakarzinoms für den Einsatz in adoptiven T-Zell-Therapie von Brustkrebs. Das Protokoll umfasst die Aktivierung von T-Zellen mit bryostatin-1/ionomycin (B / I) und IL-2 in Abwesenheit von Tumor-Antigenen für 16 Stunden. B / I Aktivierung imitiert intrazelluläre Signale, die sich in T-Zell-Aktivierung durch die Erhöhung Proteinkinase C Aktivität und den intrazellulären Kalzium-, bzw. 4. Dieses Protokoll ausdrücklich aktiviert tumor-spezifische T-Zellen, während das Töten irrelevant T-Zellen. Die B / I-aktivierten T-Zellen werden mit IL-7 und IL-15 für 24 Stunden kultiviert und anschließend mit IL-2 gepulst. Nach 24 Stunden, T-Zellen werden gewaschen, halbiert und mit kultivierten IL-7 + IL-15 für weitere 4 Tage. Tumor-Spezifität und anti-Tumor-Wirksamkeit des ex vivo expandierten T-Zellen bestimmt.

Protocol

1. Isolierung von Lymphozyten 5 Isolieren Tumor-drainierenden Lymphknoten oder Milz von tumortragenden FVBN202 transgenen Mäusen und bereiten einzelne Zellsuspension in eiskaltem RPMI1640 mit 10% FBS. B / I-Aktivierung in 50-ml-Polypropylen-konische Gefäße führt zu einer größeren T-Zell-Ausbeute auf Polystyrol-Röhrchen verglichen. Ketamin und Xylazin injiziert ip für die Anästhesie. Genickbruch ist als eine Methode der Euthanasie verwendet. Kultur der Zellen (10 6 Zell…

Discussion

Selektiver Ausbau von Tumor-reaktiven T-Zellen mit Effektorfunktionen Anti-Tumor-Funktion kann durch das vorgeschlagene Protokoll mit B erreicht werden / I Aktivierung und ex vivo Expansion mit der gamma-Kette Zytokine IL-2, IL-7 und IL-15. Während IL-2 ist ein T-Zell-Wachstumsfaktor, der die Differenzierung und Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen unterstützt, können IL-7 inhibiert die Apoptose von T-Zellen und unterstützen ihre Lebensfähigkeit während der Expansion. IL-15 unterstützt Memory T-Ze…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde vom NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili) unterstützt. Wir danken für die Unterstützung der VCU Massey Cancer Center und dem Commonwealth Foundation for Cancer Research.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bryostatin 1   Sigma B7431-10ug  
Ionomycin   Calbiochem 407950  
Mouse IL-7   PeproTech 217-17  
Mouse IL-15   PeproTech 210-15  
Human IL-2   PeproTech 200-02  
RPMI1640   Invitrogen 11875  
FBS   Gemini 100-106  
Penicillin/Streptomycin   Cellgro 30-002-CI  
L- glutamine   Invitrogen 25030081  
β- mercaptoethanol   Sigma M7522  
anti-CD16/32 antibody   Biolegend 101302  
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit   BD Pharmingen 556547  
FITC-CD4   Biolegend 100406  
PE-CD8   Biolegend 100708  
anti-c-Erb2/c–Neu   Calbiochem OP16  
PE- anti mouse IgG   Biolegend 405307  
formaldehyde   Polysciences 04018  
Hemocytometer   Hycor 87144  
Light microscope   VWR V200073  
Mouse IFN-γ ELISA set   BD Pharmingen 555138  
Cell culture flasks   Greiner 658175  

References

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Cite This Article
Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

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