Summary

Ex vivo Uitbreiding van Tumor-reactieve T-cellen door middel van Bryostatin 1/Ionomycin en de Gemeenschappelijke Gamma Chain Cytokines Formulering

Published: January 14, 2011
doi:

Summary

Een efficiënte protocol voor de<em> Ex vivo</em> Uitbreiding van de tumor-reactieve T-cellen van tumor-drainerende lymfeklieren of andere secundaire lymfoïde weefsels van tumor-dragende hosts wordt beschreven. Dit protocol breidt selectief tumor-specifieke T-cellen voor gebruik in de adoptieve immunotherapie van borstkanker.

Abstract

Er werd gemeld dat borstkanker bij pre-bestaande immuunrespons tegen hun tumoren 1,2 te hebben. Echter, een dergelijke immuunreacties geen volledige bescherming bieden tegen de ontwikkeling of herhaling van borstkanker. Om dit probleem te verhelpen door het verhogen van de frequentie van de tumor-reactieve T-cellen, is adoptieve immunotherapie in dienst. Een verscheidenheid aan protocollen die zijn gebruikt voor de uitbreiding van tumor-specifieke T-cellen. Deze protocollen zijn echter beperkt tot het gebruik van tumor antigenen ex vivo voor de activatie van antigeen-specifieke T-cellen. Zeer recent hebben gemeenschappelijke gamma-keten cytokinen zoals IL-2, IL-7, IL-15 en IL-21 is alleen of in combinatie worden gebruikt voor de versterking van de anti-tumor immuunrespons 3. Het is echter niet duidelijk wat formulering zou het beste werken voor de uitbreiding van de tumor-reactieve T-cellen. Hier presenteren wij een protocol voor de selectieve activering en uitbreiding van tumor-reactieve T-cellen uit de FVBN202 transgene muis-model van HER-2/neu positief borstcarcinoom voor gebruik in de adoptieve T cel-therapie van borstkanker. Het protocol bevat activatie van T-cellen met bryostatin-1/ionomycin (B / I) en IL-2 in de afwezigheid van tumor antigenen gedurende 16 uur. B / I activering nabootst intracellulaire signalen die resulteren in een T-cel activatie door het verhogen van proteïne kinase C-activiteit en intracellulair calcium, respectievelijk 4. Dit protocol activeert specifiek tumor-specifieke T-cellen, terwijl het doden van niet ter zake T-cellen. De B ​​/ I-geactiveerde T-cellen worden gekweekt met IL-7 en IL-15 voor 24 uur en dan gepulst met IL-2. Na 24 uur, T-cellen worden gewassen, splitsen en gekweekt met IL-7 + IL-15 voor extra 4 dagen. Tumor-specificiteit en anti-tumor effectiviteit van de ex vivo geëxpandeerde T-cellen wordt bepaald.

Protocol

1. Isolatie van Lymfocyten 5 Isoleer tumor-drainerende lymfeklieren of milt van tumor-dragende FVBN202 transgene muizen en voor te bereiden enkele celsuspensie in ijskoud RPMI1640 aangevuld met 10% FBS. B / I activering in 50 ml polypropyleen conische buizen resulteert in een grotere T-cel-opbrengst in vergelijking met polystyreen buizen. Ketamine en xylazine worden geïnjecteerd ip voor anesthesie. Cervicale dislocatie wordt gebruikt als een methode van euthanasie. Cultuur van de cellen …

Discussion

Selectieve uitbreiding van tumor-reactieve T-cellen met effector anti-tumor-functie kan worden bereikt door het voorgestelde protocol met behulp van B / I-activering en ex vivo expansie met de gamma-keten cytokines IL-2, IL-7 en IL-15. Terwijl de IL-2 is een T-cel groeifactor die de differentiatie en uitbreiding van antigeen-specifieke T-cellen kan ondersteunen, kan IL-7 remmen apoptose van T-cellen en ondersteuning van hun levensvatbaarheid tijdens de expansie. IL-15 kan ondersteunen geheugen T-cellen die bela…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd ondersteund door NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili). Wij dankbaar de steun van VCU Massey Cancer Center en de Commonwealth Foundation for Cancer Research.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bryostatin 1   Sigma B7431-10ug  
Ionomycin   Calbiochem 407950  
Mouse IL-7   PeproTech 217-17  
Mouse IL-15   PeproTech 210-15  
Human IL-2   PeproTech 200-02  
RPMI1640   Invitrogen 11875  
FBS   Gemini 100-106  
Penicillin/Streptomycin   Cellgro 30-002-CI  
L- glutamine   Invitrogen 25030081  
β- mercaptoethanol   Sigma M7522  
anti-CD16/32 antibody   Biolegend 101302  
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit   BD Pharmingen 556547  
FITC-CD4   Biolegend 100406  
PE-CD8   Biolegend 100708  
anti-c-Erb2/c–Neu   Calbiochem OP16  
PE- anti mouse IgG   Biolegend 405307  
formaldehyde   Polysciences 04018  
Hemocytometer   Hycor 87144  
Light microscope   VWR V200073  
Mouse IFN-γ ELISA set   BD Pharmingen 555138  
Cell culture flasks   Greiner 658175  

References

  1. Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
  2. Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
  3. Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
  4. Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
  5. Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
  6. Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
  7. Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
  8. Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
  9. Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
  10. Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
  11. Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

View Video