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Immunology and Infection

पूर्व ट्यूमर प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की Bryostatin 1/Ionomycin का मतलब द्वारा vivo विस्तार और आम गामा चेन साइटोकिन्स निरूपण

doi: 10.3791/2381 Published: January 14, 2011

Summary

के लिए एक कुशल प्रोटोकॉल

Abstract

यह बताया गया है कि स्तन कैंसर के रोगियों, उनके ट्यूमर 1,2 के खिलाफ पहले से मौजूद प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया है. हालांकि, इस तरह के प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए या स्तन कैंसर के विकास पुनरावृत्ति के खिलाफ पूरी सुरक्षा प्रदान करने में विफल. ट्यूमर प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की आवृत्ति को बढ़ाने के द्वारा इस समस्या पर काबू पाने के लिए, दत्तक immunotherapy के नियोजित किया गया है. प्रोटोकॉल की एक किस्म ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं के विस्तार के लिए इस्तेमाल किया गया है. इन प्रोटोकॉल, तथापि, प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की सक्रियता के लिए ट्यूमर प्रतिजनों पूर्व vivo का उपयोग करने के लिए प्रतिबंधित कर रहे हैं. अभी हाल ही में, आईएल -2, आईएल -7, आईएल 15, और आईएल-21 के रूप में आम गामा श्रृंखला साइटोकिन्स विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा 3 प्रतिक्रियाओं की वृद्धि के लिए किया गया है अकेले या संयोजन में उपयोग किया. हालांकि, यह स्पष्ट नहीं है सूत्रीकरण ट्यूमर प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं के विस्तार के लिए सबसे अच्छा क्या काम करेगा. यहाँ हम चयनात्मक सक्रियण और FVBN202 HER-2/neu स्तन कैंसर के दत्तक टी सेल थेरेपी में उपयोग के लिए सकारात्मक स्तन कार्सिनोमा के ट्रांसजेनिक माउस मॉडल से ट्यूमर प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं के विस्तार के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं. bryostatin-1/ionomycin (बी / मैं) और आईएल -2 के साथ 16 घंटे के लिए ट्यूमर प्रतिजनों के अभाव में टी कोशिकाओं की सक्रियता प्रोटोकॉल शामिल हैं. बी / मैं सक्रियण intracellular संकेतों mimics कि प्रोटीन kinase सी गतिविधि और intracellular कैल्शियम में वृद्धि, क्रमशः 4 टी सेल सक्रियण में परिणाम . इस प्रोटोकॉल विशेष रूप से ट्यूमर विशेष टी कोशिकाओं को सक्रिय है, जबकि अप्रासंगिक टी कोशिकाओं की मौत हो गई. बी / मैं सक्रिय टी कोशिकाओं आईएल-7 और आईएल -15 के साथ 24 घंटे के लिए सुसंस्कृत हैं और फिर आईएल-2 के साथ स्पंदित है. 24 घंटे के बाद, टी कोशिकाओं को धोया हैं, विभाजन, और के साथ सुसंस्कृत आईएल -7 + अतिरिक्त 4 दिनों के लिए आईएल-15. पूर्व vivo विस्तार टी कोशिकाओं के ट्यूमर विशिष्टता और विरोधी ट्यूमर प्रभावकारिता निर्धारित किया जाता है.

Protocol

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1. 5 लिम्फोसाइटों के अलगाव

  1. पृथक draining ट्यूमर लिम्फ नोड्स या ट्यूमर असर FVBN202 ट्रांसजेनिक चूहों से spleens और RPMI1640 बर्फ ठंड में एकल कक्ष निलंबन तैयार 10% FBS के साथ पूरक. Polystyrene ट्यूब की तुलना में अधिक से अधिक टी सेल उपज में 50 मिलीलीटर polypropylene शंक्वाकार ट्यूबों परिणाम में बी / मैं सक्रियण. Ketamine और Xylazine संज्ञाहरण के लिए आईपी अंतःक्षिप्त रहे हैं. सरवाइकल अव्यवस्था इच्छामृत्यु की एक विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है.
  2. पूरा माध्यम से संस्कृति (10 6 कोशिकाओं / एमएल) 16 एच. के लिए (5 एनएम) bryostatin-1 और ionomycin (1 सुक्ष्ममापी) के साथ 80 यू / आईएल -2 (Peprotech) एमएल के साथ 15% FBS युक्त कोशिकाओं
  3. कोशिकाओं को गर्म मध्यम (37 डिग्री सेल्सियस) और 10 6 पूरा माध्यम से कोशिकाओं / एमएल संस्कृति (10 एनजी / एमएल) आईएल-7 और आईएल -15 (10 एनजी / एमएल) (Peprotech) के साथ 24 घंटे के लिए के साथ तीन बार धो .
  4. आईएल 2 (40 यू / एमएल) के साथ 24 एच. के लिए कोशिकाओं का पल्स
  5. कोशिकाओं और आईएल-7 और आईएल -15 के साथ उन्हें संस्कृति (10 एनजी / एमएल) के 4 और अधिक दिनों के लिए भाजित. मध्यम बदलें और विभाजित कोशिकाओं है अगर 2 दिनों हर जरूरत.

2. सेल गिनता है और प्रवाह cytometry 5 विश्लेषण द्वारा टी कोशिकाओं की मोड़ो विस्तार निर्धारित

  1. प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा सेल मायने रखता है
    1. Trypan नीले में उचित सेल कमजोर पड़ने (1:100) तैयार करें और hemocytometer पर कुछ μL जोड़ने
    2. 9 चौकों की गणना और कमजोर पड़ने कारक से गुणा कक्षों की संख्या कोशिकाओं की गिनती विभाजित करके कुल सेल नंबर निर्धारित हैं. परिणाम x 10 4 कोशिकाओं / एमएल नंबर पेश करेंगे.
  2. प्रवाह cytometry द्वारा विस्तारित कोशिकाओं में सीडी 8 + और सीडी 4 + टी कोशिकाओं के अनुपात निर्धारित
    1. Anti-CD16/CD32 एंटीबॉडी (Biolegend) के साथ बर्फ पर 20 मिनट के लिए गैर विशिष्ट एंटीबॉडी के संवर्धन द्वारा एफसी रिसेप्टर्स के लिए बाध्य कोशिकाओं और ब्लॉक तो कोशिकाओं को ठंडा पीबीएस के 2 एमएल के साथ दो बार धोने 1% सोडियम azide के साथ पूरक .
    2. बर्फ पर 20 मिनट के लिए और FITC CD4 पीई-CD8 एंटीबॉडी के साथ संवर्धन द्वारा कोशिकाओं दाग और फिर कोशिकाओं ठंडा पीबीएस के 2 एमएल% 1 FBS और 0.1% सोडियम azide के साथ पूरक के साथ दो बार धोने.
    3. 1% paraformaldehyde के साथ कोशिकाओं को ठीक करने और नमूने के Beckman कल्टर एफसी 500 पर चलाने के लिए और शिखर सम्मेलन संस्करण 4.3 सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण.

3. पूर्व Vivo के ट्यूमर - विशिष्टता का निर्धारण टी कोशिकाओं विस्तारित

  1. संस्कृति पूर्व vivo विकिरणित Neu सकारात्मक एमएमसी ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एक 10:1 अनुपात (15,000 रेड) में एच. 24, 5 के लिए पूरा मध्यम में लिम्फोसाइटों का विस्तार
  2. हार्वेस्ट supernatants दुकान और -80 पर 5,6 डिग्री सेल्सियस जब तक इस्तेमाल किया.
  3. पता लगाएँ IFN-γ निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार एक माउस का उपयोग IFN-γ एलिसा सेट (बी Pharmingen). 5,6

4. पूर्व Vivo विस्तारित टी 5,6 कक्ष के फंक्शन विरोधी ट्यूमर का निर्धारण

  1. पूरा मध्यम में 48 घंटे के लिए 3 एमएल पूरा मध्यम (RPMI 1640 पेनिसिलिन के 100U / एमएल, 100μg / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10% FBS, glutamine और β के साथ पूरक में लक्ष्य के अनुपात: सेते ट्यूमर कोशिकाओं के साथ एक 10:1 effector टी कोशिकाओं में -) mercaptoethanol और एमएल / 6 अच्छी तरह से संस्कृति 37 ° सी / 5% सीओ 2 व्यंजन में आईएल -2 (Peprotech) के 20U.
  2. Neu के लिए तीन रंग एंटीबॉडी धुंधला (anti-c-Erb2/c-neu, क्लोन 4, Calbiochem) पीई विरोधी माउस आईजीजी Annexin वि FITC और Propidium आयोडाइड (PI) निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसार (बी Pharmingen) द्वारा पीछा किया प्रदर्शन
  3. ट्यूमर कोशिकाओं के Neu सकारात्मक ट्यूमर कोशिकाओं पर गेट और विश्लेषण व्यवहार्यता (Annexin V-/PI-)

5. स्तन कैंसर के माउस मॉडल

FVBN202 ट्रांसजेनिक मादा चूहों (चार्ल्स नदी प्रयोगशालाओं) ट्यूमर प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं के स्रोत के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इन चूहों MMTV प्रमोटर के विनियमन के तहत एक unactivated चूहे Neu transgene overexpress और एक परिणाम के रूप में 7 उम्र के 4-10 महीने के बीच सहज स्तन कार्सिनोमा का विकास. इन चूहों premalignant स्तन hyperplasia के बगल में ductal कार्सिनोमा (DCIS) carcinoma8 सहज के विकास के लिए पहले करने के लिए इसी तरह की विकसित . स्वतःस्फूर्त ट्यूमर असर चूहों टी कोशिकाओं के दाताओं के रूप में उपयोग किया जाता है.

6. प्रतिनिधि परिणाम:

भोले टी कोशिकाओं है कि vivo में ट्यूमर के साथ अवगत नहीं हैं की हत्या में 16 घंटे के परिणामों के लिए / मैं बी के साथ टी कोशिकाओं के सक्रियकरण. ट्यूमर प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं वे 2.8 गुना गामा श्रृंखला साइटोकिन्स (चित्रा 1) के साथ एक संस्कृति 6 दिन के भीतर विस्तार के चयनात्मकता / बी मैं के बाद. दोनों सीडी 8 + और सीडी 4 + टी कोशिकाओं गामा श्रृंखला साइटोकिन्स (चित्रा 2) के साथ समान रूप से विस्तार कर रहे हैं. पूर्व vivo विस्तार टी कोशिकाओं ट्यूमर के खिलाफ उच्च जवाबदेही है कि दाता चूहों को अवगत थे, Neu सकारात्मक माउस स्तन कार्सिनोमा (एमएमसी) ट्यूमर कोशिकाओं (चित्रा 3) की उपस्थिति में IFN-γ उत्पादन द्वारा मूल्यांकन के रूप में दिखाते हैं. पूर्व vivo विस्तार टी कोशिकाओं में apoptosis Neu सकारात्मक एमएमसी ट्यूमर cel पैदा कर सकते हैंरास ऐसी है कि ट्यूमर कोशिकाओं के व्यवहार्यता 92% से 48 घंटे के भीतर 61% (चित्रा 4) के लिए चला जाता है.

गुम चित्रा
चित्रा 1 लिम्फोसाइटों के अलग अलग समय बिंदुओं पर मोड़ो बी / मैं (1 दिन) सक्रियण और गामा श्रृंखला साइटोकिन्स के साथ पूर्व vivo विस्तार (3 दिन, 5, और 7) निम्नलिखित विस्तार.

गुम चित्रा
चित्रा 2 सीडी 4 + और ​​CD8 + टी कोशिकाओं की कुल प्रतिशत से पहले और 7 दिन के बाद गामा श्रृंखला साइटोकिन्स के साथ एक विस्तार ..

गुम चित्रा
चित्रा 3 ट्यूमर उत्तेजित IFN-γ से पहले और बाद गामा श्रृंखला साइटोकिन्स के साथ एक 7 दिन विस्तार ट्यूमर असर चूहों से अलग टी कोशिकाओं द्वारा उत्पादन का उपयोग करते हुए IFN-γ एलिसा.

गुम चित्रा
चित्रा 4 पूर्व vivo गामा श्रृंखला साइटोकिन्स साथ Neu सकारात्मक माउस स्तन कार्सिनोमा (एमएमसी) ट्यूमर कोशिकाओं के खिलाफ टी कोशिकाओं का विस्तार की साइटोटोक्सिक समारोह.

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Discussion

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ट्यूमर प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं की विरोधी ट्यूमर effector समारोह के साथ चयनात्मक विस्तार प्रस्तावित प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए बी के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है / मैं सक्रियण और गामा श्रृंखला आईएल -2 साइटोकिन्स, आईएल -7 और आईएल -15 के साथ पूर्व vivo विस्तार. जबकि 2 - आईएल टी सेल वृद्धि कारक है कि और प्रतिजन विशेष टी कोशिकाओं की भिन्नता और विस्तार का समर्थन कर सकते हैं, आईएल -7 टी कोशिकाओं की apoptosis को बाधित और विस्तार के दौरान उनकी व्यवहार्यता का समर्थन कर सकते हैं. आईएल -15 स्मृति टी कोशिकाओं है कि दत्तक टी सेल थेरेपी 9-11 पर लंबी अवधि के विरोधी ट्यूमर प्रतिक्रियाओं को पैदा करने के लिए महत्वपूर्ण हैं का समर्थन कर सकते हैं. और इन साइटोकिन्स के क्रम संयोजन बदलने विस्तार टी कोशिकाओं जो बारी में सुधार या उनकी प्रभावकारिता 12 विरोधी ट्यूमर को कम कर सकते हैं के भेदभाव को प्रभावित कर सकता है. प्रस्तावित प्रोटोकॉल ट्यूमर प्रतिजनों की पहचान नहीं की आवश्यकता होगी. ट्यूमर विरोधी ट्यूमर टी कोशिकाओं कि कैंसर के रोगियों के दत्तक टी सेल थेरेपी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की उच्च संख्या के उत्पादन में प्रतिक्रियाशील टी कोशिकाओं के परिणाम के चयनात्मक विस्तार. हम पहले से पता चला है कि पूर्व vivo टी कोशिकाओं का विस्तार संरक्षित जानवरों दत्तक टी सेल थेरेपी के बाद स्तन कैंसर के खिलाफ.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgments

यह काम एनआईएच R01 CA104757 अनुदान (महाराष्ट्र Manjili) द्वारा समर्थित किया गया. हम कृतज्ञता VCU Massey कैंसर केंद्र के समर्थन और कैंसर अनुसंधान के लिए राष्ट्रमंडल फाउंडेशन को स्वीकार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bryostatin 1 Sigma-Aldrich B7431-10ug
Ionomycin Calbiochem 407950
Mouse IL-7 PeproTech Inc 217-17
Mouse IL-15 PeproTech Inc 210-15
Human IL-2 PeproTech Inc 200-02
RPMI1640 Invitrogen 11875
FBS Gemini Bio Products 100-106
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-CI
L- glutamine Invitrogen 25030081
β- mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522
anti-CD16/32 antibody Biolegend 101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit BD Biosciences 556547
FITC-CD4 Biolegend 100406
PE-CD8 Biolegend 100708
anti-c-Erb2/c–Neu Calbiochem OP16
PE- anti mouse IgG Biolegend 405307
formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Hemocytometer Hycor 87144
Light microscope VWR international V200073
Mouse IFN-γ ELISA set BD Biosciences 555138
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175

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References

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Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).More

Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

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