Summary

Ex vivo expansion av tumör-reaktiva T celler på ett Bryostatin 1/Ionomycin och den gemensamma Gamma Cytokiner Chain Formulering

Published: January 14, 2011
doi:

Summary

Ett effektivt protokoll för<em> Ex vivo</em> Utbyggnad av tumörreaktiva T-celler från tumören dränerande lymfkörtlar eller andra sekundära lymfoida vävnader av tumör-bärande värdar beskrivs. Detta protokoll expanderar selektivt tumör-specifika T-celler för användning i adoptiv immunterapi av bröstcancer.

Abstract

Det rapporterades att bröstcancer patienter har tidigare immunsvar mot sina tumörer 1,2. Sådana immunsvaret inte ger fullständigt skydd mot utveckling eller återfall av bröstcancer. För att lösa detta problem genom att öka frekvensen av tumörreaktiva T-celler, har adoptiv immunterapi använts. En mängd olika protokoll som har använts för utbyggnad av tumör-specifika T-celler. Dessa protokoll är dock begränsad till användning av tumörantigen ex vivo för aktivering av antigen-specifika T-celler. Helt nyligen har gemensamma gamma kedjan cytokiner såsom IL-2, IL-7, IL-15 och IL-21 har använts ensamt eller i kombination för att höja anti-tumör immunsvar 3. Det är dock inte klart vilken formulering skulle fungera bäst för utbyggnaden av tumörreaktiva T-celler. Här presenterar vi ett protokoll för selektiv aktivering och expansion av tumörreaktiva T-celler från FVBN202 transgena musmodell av HER-2/neu positiv bröstcancer för användning i adoptiv T cells behandling av bröstcancer. Protokollet inkluderar aktivering av T celler med bryostatin-1/ionomycin (B / I) och IL-2 i avsaknad av tumörantigen i 16 timmar. B / I aktivering härmar intracellulära signaler som leder till T-cell aktivering genom att öka proteinkinas C-aktivitet och intracellulär kalcium, respektive 4. Detta protokoll aktiverar specifikt tumör-specifika T-celler medan dödar irrelevanta T-celler. The B / I-aktiverade T-celler odlas med IL-7 och IL-15 för 24 timmar och sedan pulsade med IL-2. Efter 24 timmar är T-cellerna tvättas, split, och odlade med IL-7 + IL-15 för ytterligare 4 dagar. Tumör-specificitet och anti-tumör effekt av fritt expanderat vivo T-celler bestäms.

Protocol

1. Isolering av lymfocyter 5 Isolera tumör-dränerande lymfkörtlar eller mjälte från tumör-bärande FVBN202 transgena möss och förbereda enskild cell suspension i iskallt RPMI1640 kompletterad med 10% FBS. B / I-aktivering i 50-ml polypropylen koniska rör resulterar i en större T-cell avkastning jämfört med polystyren rör. Ketamin och xylazin injiceras IP för anestesi. Halsdislokation används som en metod för dödshjälp. Kultur cellerna (10 6 celler / ml) i komp…

Discussion

Selektiv expansion av tumör-reaktiva T-celler med effektormedierad anti-tumör-funktionen kan uppnås genom det föreslagna protokollet med B / I aktivering och ex vivo expansion med de cytokiner gamma-kedjan IL-2, IL-7 och IL-15. Medan IL-2 är en T-cell tillväxtfaktor som kan stödja differentiering och expansion av antigen-specifika T-celler, kan IL-7 hämmar apoptos av T-celler och stödja deras livskraft under expansion. IL-15 kan stödja celler minne T som är viktiga för att generera långsiktigt anti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete stöddes av NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili). Vi erkänner tacksamt stöd av OAV Massey Cancer Center och Commonwealth Stiftelsen för cancerforskning.

Materials

Material Name Type Company Catalogue Number Comment
Bryostatin 1   Sigma B7431-10ug  
Ionomycin   Calbiochem 407950  
Mouse IL-7   PeproTech 217-17  
Mouse IL-15   PeproTech 210-15  
Human IL-2   PeproTech 200-02  
RPMI1640   Invitrogen 11875  
FBS   Gemini 100-106  
Penicillin/Streptomycin   Cellgro 30-002-CI  
L- glutamine   Invitrogen 25030081  
β- mercaptoethanol   Sigma M7522  
anti-CD16/32 antibody   Biolegend 101302  
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit   BD Pharmingen 556547  
FITC-CD4   Biolegend 100406  
PE-CD8   Biolegend 100708  
anti-c-Erb2/c–Neu   Calbiochem OP16  
PE- anti mouse IgG   Biolegend 405307  
formaldehyde   Polysciences 04018  
Hemocytometer   Hycor 87144  
Light microscope   VWR V200073  
Mouse IFN-γ ELISA set   BD Pharmingen 555138  
Cell culture flasks   Greiner 658175  

References

  1. Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
  2. Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
  3. Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
  4. Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
  5. Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
  6. Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
  7. Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
  8. Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
  9. Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
  10. Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
  11. Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).

Play Video

Cite This Article
Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

View Video