Ex vivo expansion av tumör-reaktiva T celler på ett Bryostatin 1/Ionomycin och den gemensamma Gamma Cytokiner Chain Formulering
Summary
Ett effektivt protokoll för<em> Ex vivo</em> Utbyggnad av tumörreaktiva T-celler från tumören dränerande lymfkörtlar eller andra sekundära lymfoida vävnader av tumör-bärande värdar beskrivs. Detta protokoll expanderar selektivt tumör-specifika T-celler för användning i adoptiv immunterapi av bröstcancer.
Abstract
Det rapporterades att bröstcancer patienter har tidigare immunsvar mot sina tumörer 1,2. Sådana immunsvaret inte ger fullständigt skydd mot utveckling eller återfall av bröstcancer. För att lösa detta problem genom att öka frekvensen av tumörreaktiva T-celler, har adoptiv immunterapi använts. En mängd olika protokoll som har använts för utbyggnad av tumör-specifika T-celler. Dessa protokoll är dock begränsad till användning av tumörantigen ex vivo för aktivering av antigen-specifika T-celler. Helt nyligen har gemensamma gamma kedjan cytokiner såsom IL-2, IL-7, IL-15 och IL-21 har använts ensamt eller i kombination för att höja anti-tumör immunsvar 3. Det är dock inte klart vilken formulering skulle fungera bäst för utbyggnaden av tumörreaktiva T-celler. Här presenterar vi ett protokoll för selektiv aktivering och expansion av tumörreaktiva T-celler från FVBN202 transgena musmodell av HER-2/neu positiv bröstcancer för användning i adoptiv T cells behandling av bröstcancer. Protokollet inkluderar aktivering av T celler med bryostatin-1/ionomycin (B / I) och IL-2 i avsaknad av tumörantigen i 16 timmar. B / I aktivering härmar intracellulära signaler som leder till T-cell aktivering genom att öka proteinkinas C-aktivitet och intracellulär kalcium, respektive 4. Detta protokoll aktiverar specifikt tumör-specifika T-celler medan dödar irrelevanta T-celler. The B / I-aktiverade T-celler odlas med IL-7 och IL-15 för 24 timmar och sedan pulsade med IL-2. Efter 24 timmar är T-cellerna tvättas, split, och odlade med IL-7 + IL-15 för ytterligare 4 dagar. Tumör-specificitet och anti-tumör effekt av fritt expanderat vivo T-celler bestäms.
Protocol
Discussion
Selektiv expansion av tumör-reaktiva T-celler med effektormedierad anti-tumör-funktionen kan uppnås genom det föreslagna protokollet med B / I aktivering och ex vivo expansion med de cytokiner gamma-kedjan IL-2, IL-7 och IL-15. Medan IL-2 är en T-cell tillväxtfaktor som kan stödja differentiering och expansion av antigen-specifika T-celler, kan IL-7 hämmar apoptos av T-celler och stödja deras livskraft under expansion. IL-15 kan stödja celler minne T som är viktiga för att generera långsiktigt anti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili). Vi erkänner tacksamt stöd av OAV Massey Cancer Center och Commonwealth Stiftelsen för cancerforskning.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bryostatin 1 | Sigma | B7431-10ug | ||
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | ||
| Mouse IL-7 | PeproTech | 217-17 | ||
| Mouse IL-15 | PeproTech | 210-15 | ||
| Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | ||
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | ||
| FBS | Gemini | 100-106 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | ||
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | ||
| β- mercaptoethanol | Sigma | M7522 | ||
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | ||
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Pharmingen | 556547 | ||
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | ||
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | ||
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | ||
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | ||
| formaldehyde | Polysciences | 04018 | ||
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | ||
| Light microscope | VWR | V200073 | ||
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Pharmingen | 555138 | ||
| Cell culture flasks | Greiner | 658175 |
References
- Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
- Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
- Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
- Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
- Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
- Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
- Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
- Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
- Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
- Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
- Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
