Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Bryostatin 1/Ionomycin Yoluyla Tümör-reaktif T hücrelerinin ex vivo Genişleme ve Ortak Gama Zinciri Sitokinler Formülasyon

doi: 10.3791/2381 Published: January 14, 2011

Summary

Için verimli bir protokol

Abstract

Meme kanseri hastalarının, tümörler 1,2 karşı önceden var olan bağışıklık yanıtlarını olduğu bildirilmiştir . Ancak, bu tür bağışıklık yanıtlarını meme kanseri geliştirme veya nüks karşı tam koruma sağlamak için başarısız olur. Tümör-reaktif T hücrelerinin sıklığı artırarak bu sorunu aşmak için, evlatlık immünoterapi istihdam edilmiştir. Tümör spesifik T hücrelerinin genişlemesi için çeşitli protokoller kullanılmaktadır. Bu protokoller, ancak tümör antijenleri ex vivo antijen-spesifik T hücrelerinin aktivasyonu için kullanımı sınırlıdır. Çok yakın bir zamanda, ortak gama zinciri sitokinler, IL-2, IL-7, IL-15, ve IL-21 gibi, anti-tümör immün yanıtların 3 geliştirme için tek başına veya kombine olarak kullanılır olmuştur. Ancak, bu formülasyon, tümör-reaktif T hücrelerinin genişlemesi için en iyi çalışmalarınızı ne açık değildir. Burada HER-2/neu evlatlık T hücre tedavisi meme kanseri kullanmak için pozitif meme kanseri FVBN202 transgenik fare modelinde tümör-reaktif T hücrelerinin selektif aktivasyonu ve genişleme için bir protokol mevcut. Bu protokol, 16 saat boyunca tümör antijenleri yokluğunda bryostatin-1/ionomycin (B / I) ve IL-2 ile T hücrelerinin aktivasyonunu içerir. B / I aktivasyonu hücre içi sinyalleri taklit eden, sırasıyla 4, protein kinaz C aktivitesi ve hücre içi kalsiyum artırarak T hücre aktivasyonu ile sonuçlanabilir . Bu protokol ilgisiz T hücreleri öldürüyor iken, özellikle tümör spesifik T hücrelerini aktive eder. B / I-aktive T hücreleri, IL-7 ve IL-15 ile 24 saat boyunca kültür ve sonra IL-2 ile darbeli. 24 saat sonra, T hücreleri, split yıkanmış ve kültürlü, IL-7 + ek 4 gün IL-15. Ex vivo genişletilmiş T hücrelerinin tümör özgüllük ve anti-tümör etkinliği belirlenir.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Lenfositler 5 izolasyonu

  1. Isolate tümör drenaj lenf düğümleri veya FVBN202 tümör taşıyan transgenik farelerin dalak ve buz RPMI1640 tek hücre süspansiyonu hazırlamak% 10 FBS ile desteklenmiştir. Polistiren tüplere göre daha büyük bir T hücre verimi 50 ml polipropilen konik tüpler sonuçları B / I aktivasyon. Ketamin ve Xylazine anestezi için ip enjekte edilir. Servikal dislokasyon ötenazi bir yöntem olarak kullanılmaktadır.
  2. Kültür bryostatin-1 (5 nM) ve ionomycin (1 mcM) ile 80 U / ml, IL-2 (Peprotech) ile birlikte 16 saat boyunca% 15 FBS içeren tam bir ortamda hücrelerin (10 6 hücre / ml )
  3. IL-7 (10 ng / ml) ve IL-15 (10 ng / ml) (Peprotech) ile 24 saat boyunca tam bir ortamda 10 6 hücre / ml sıcak ortam (37 ° C) ve kültür hücreleri üç kez yıkayın .
  4. IL-2 (40 U / ml) ile 24 saat hücrelerin Darbe
  5. Split IL-7 ve IL-15 ile 4 gün boyunca daha fazla hücre ve kültür (10 ng / ml). Orta Değişim ve 2 günde gerektiğinde hücreleri bölme.

2. Hücre sayar ve Akış Sitometri Analizi 5 T Hücre Katlama Genişleme belirleyin

  1. Işık mikroskobu ile hücre sayımı
    1. Tripan mavisi uygun hücre seyreltme (1:100) hazırlayın ve üzerine birkaç mcL hemasitometre
    2. 9 kareler sayın ve seyreltme faktörü ile çarpılır odaları sayısına bölünmesi ile hücre sayıları toplam hücre sayısını belirlemek. Sonuç sayısı x 10 4 hücre / mL sunacak.
  2. Flow sitometri ile genişletilmiş hücreleri CD8 + ve CD4 + T hücreleri oranı belirleme
    1. 20 dakika buz üzerinde anti-CD16/CD32 antikor (Biolegend) ile kültür Fc reseptörlerine karşı antikorlar non-spesifik bağlayıcı hücreleri Blok ve ardından buz gibi soğuk PBS 2 mL hücreler iki kez yıkamak% 1 sodyum azid ile desteklenmiş .
    2. 20 dakika buz üzerinde FITC CD4 ve PE-CD8 antikorlar ile kültür hücreleri tarafından Leke ve daha sonra 2 ml% 1 FBS ve% 0,1 sodyum azid ile tamamlanan buz gibi soğuk PBS ile hücreler iki kez yıkayın.
    3. % 1 paraformaldehid hücreleri saptamak ve Beckman Coulter FC 500 numunelerinin çalışılabilmesi ve Zirvesi sürüm 4.3 yazılımı kullanılarak analiz.

3. Eski Vivo Tümör özgüllüğü belirleyin T Hücreler Genişletilmiş

  1. Kültür ex vivo ışınlanmış neu pozitif MMC tümör hücreleri ile 10:1 oranını (15.000 rad) 24 saat 5 tam orta lenfosit genişletti
  2. -80 ° C'ye kadar Hasat süpernatantlar ve saklayın. 5,6
  3. Algılama IFN-γ üreticinin protokole göre Fare IFN-γ ELISA Seti (BD Pharmingen) ile 5,6

4. Eski Vivo Genişletilmiş T Hücreleri 5,6 Anti-tümör Fonksiyon belirleyin

  1. 3 ml tam orta (RPMI-1640 100U / ml penisilin, 100μg / ml streptomisin, glutamin ve β% 10 FBS ile takviye tam bir ortamda 48 saat süreyle hedef oranları: 10:1 efektör T hücrelerinin tümör hücreleri ile inkübe - merkaptoetanol) ve 6 kuyu kültür yemekleri 37 ° C /% 5 CO 2, IL-2 (Peprotech) 20U / ml.
  2. Üretici firmanın protokolüne göre PE-anti-fare IgG, Annexin V-FITC ve Propidium İyodür (PI) (BD Pharmingen) tarafından takip neu için üç renk antikor boyama (anti-c-Erb2/c-neu, klon-4, Calbiochem) yapın
  3. Neu pozitif tümör hücreleri Kapısı ve analiz tümör hücrelerinin canlılığı (Annexin V-/PI-)

5. Meme Kanseri Fare Modeli

FVBN202 transgenik (Charles River Laboratuvarları) dişi farelerde tümör-reaktif T hücrelerinin kaynağı için kullanılabilir. Bu fareler MMTV organizatörü Yönetmelik kapsamında etkisizleştirilir sıçan neu transgen eksprese ve bunun sonucu olarak 4-10 ay, 7 yaş arasında spontan meme karsinomu geliştirmek . Bu farelerin spontan carcinoma8 gelişimi için önce duktal karsinoma in situ (DCIS) 'e benzer premalign meme hiperplazi gelişir. Spontan Tümör taşıyan farelere T hücre vericisi olarak kullanılır.

6. Temsilcisi Sonuçlar:

In vivo tümör duyarlı değildir naif T hücrelerinin öldürülmesi 16 saat sonuçlar için B / I ile T hücrelerinin aktivasyonu. Gama zinciri sitokinler (Şekil 1) ile 6 günlük bir kültürün içinde 2.8 kat kadar genişletmek tümör-reaktif T hücreleri B / I seçicilik sonra. CD8 + ve CD4 + T hücreleri eşit gama zinciri sitokinler (Şekil 2) ile genişletilmiş. Ex vivo genişletilmiş T hücreleri neu pozitif fare meme karsinom (MMC), tümör hücreleri (Şekil 3) varlığı, IFN-γ üretimi değerlendirilir olarak donör fareler, karşı alerjisi olan tümörlere karşı yüksek tepki gösteriyor . T hücrelerinin ex vivo genişletilmiş neu pozitif MMC tümör cel apoptozisi uyarabilirtümör hücreleri, bu canlılığı ls% 92 dan% 61 (Şekil 4) 48 saat içinde düşer.

Eksik Şekil
Şekil 1 B / I aktivasyonu (1. gün) ve gama zinciri sitokinler ile ex vivo genişlemesi (3, 5 ve 7 gün) sonra farklı zaman noktalarında lenfosit Katlama genişleme

Eksik Şekil
Şekil 2 CD4 + ve CD8 + T hücrelerinin toplam yüzdesi gama zinciri sitokinler ile 7 günlük bir genişleme öncesi ve sonrası.

Eksik Şekil
Şekil 3: Tümör-uyarılmış IFN-γ kullanarak Tümör taşıyan farelere gama zinciri sitokinler ile 7 günlük bir genişleme öncesinde ve sonrasında izole edilen T hücrelerinin üretimi, IFN-γ ELISA

Eksik Şekil
Şekil 4 Sitotoksik T hücrelerinin genişletilmiş neu pozitif fare meme karsinom (MMC), tümör hücrelerinin karşı gama zinciri sitokinler ile ex vivo fonksiyonu

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Seçici genişleme efektör anti-tümör işlevi tümör-reaktif T hücrelerinin B kullanarak önerilen protokol ile elde edilebilir I / aktivasyonu ve gama zinciri sitokinler IL-2, IL-7 ve IL-15 ile ex vivo genişlemesi. IL-2, antijen-spesifik T hücrelerinin farklılaşması ve genişleme destek T hücre büyüme faktörü iken, IL-7, T hücreleri, apoptozis inhibe eder ve genişleme sırasında canlılığı destekleyecek. IL-15, uzun vadeli bir anti-tümör cevapların evlatlık T hücre tedavisi 9-11 üzerine üretmek için önemli olan bellek T hücreleri destek olabilir . Bu sitokinlerin sipariş ve kombinasyon değiştirme, sırayla anti-tümör etkinliği 12 artırmak veya azaltmak genişletilmiş T hücre farklılaşması etkileyebilir . Önerilen protokol tümör antijenlerinin belirlenmesi gerek olmayacak. Kanser hastalarının evlatlık T hücre tedavisi için kullanılan anti-tümör T hücrelerinin yüksek sayıda üretim tümör-reaktif T hücrelerinin sonuçları seçici bir genişleme. Biz daha önce, ex vivo olarak evlat edinen T hücre tedavisi sonrası meme kanserine karşı korumalı T hücreleri hayvanlar genişletilmiş gösterilmiştir .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Bu çalışma NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili) tarafından desteklenmiştir. Biz minnetle VCU Massey Kanser Merkezi ve Commonwealth Kanser Araştırma Vakfı desteğiyle kabul etmiş sayılırsınız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bryostatin 1 Sigma-Aldrich B7431-10ug
Ionomycin Calbiochem 407950
Mouse IL-7 PeproTech Inc 217-17
Mouse IL-15 PeproTech Inc 210-15
Human IL-2 PeproTech Inc 200-02
RPMI1640 Invitrogen 11875
FBS Gemini Bio Products 100-106
Penicillin/Streptomycin Cellgro 30-002-CI
L- glutamine Invitrogen 25030081
β- mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522
anti-CD16/32 antibody Biolegend 101302
Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit BD Biosciences 556547
FITC-CD4 Biolegend 100406
PE-CD8 Biolegend 100708
anti-c-Erb2/c–Neu Calbiochem OP16
PE- anti mouse IgG Biolegend 405307
formaldehyde Polysciences, Inc. 04018
Hemocytometer Hycor 87144
Light microscope VWR international V200073
Mouse IFN-γ ELISA set BD Biosciences 555138
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goodell, V., Waisman, J., Salazar, L. G., de la Rosa, C., Link, J., Coveler, A. L., Childs, J. S., Fintak, P. A., Higgins, D. M., Disis, M. L. Level of HER-2/neu protein expression in breast cancer may affect the development of endogenous HER-2/neu-specific immunity. Mol Cancer Ther. 7, 449-454 (2008).
  2. Disis, M. L., Knutson, K. L., Schiffman, K., Rinn, K., McNeel, D. G. Pre-existent immunity to the HER-2/neu oncogenic protein in patients with HER-2/neu overexpressing breast and ovarian cancer. Breast Cancer Res Treat. 62, 245-252 (2000).
  3. Liu, S., Riley, J., Rosenberg, S., Parkhurst, M. Comparison of common gamma-chain cytokines, interleukin-2, interleukin-7, and interleukin-15 for the in vitro generation of human tumor-reactive T lymphocytes for adoptive cell transfer therapy. J. Immunother. 29, 284-293 (2006).
  4. Bear, H. D., Roberts, J., Cornell, D., Tombes, M. B., Kyle, B. Adoptive immunotherapy of cancer with pharmacologically activated lymph node lymphocytes: a pilot clinical trial. Cancer Immunol Immunother. 5, 269-274 (2001).
  5. Morales, J. K., Kmieciak, M., Graham, L., Feldmesser, M., Bear, H. D., Manjili, M. H. Adoptive transfer of HER2/neu-specific T cells expanded with alternating gamma chain cytokines mediate tumor regression when combined with the depletion of myeloid-derived suppressor cells. Cancer Immunol Immunother. 58, 941-953 (2009).
  6. Cha, E., Graham, L., Manjili, M. H., Bear, H. D., Guy, C. T., Webster, M. A., Schaller, M., Parsons, T. J., Cardiff, R. D. IL-7 + IL-15 are superior to IL-2 for the ex vivo expansion of 4T1 mammary carcinoma-specific T cells with greater efficacy against tumors in vivo. Breast Cancer Res Treat. 89, 10578-10582 (2009).
  7. Kmieciak, M., Morales, J. K., Morales, J., Bolesta, E., Grimes, M., Manjili, M. H. Danger signals and nonself entity of tumor antigen are both required for eliciting effective immune responses against HER-2/neu positive mammary carcinoma: implications for vaccine design. Cancer Immunol Immunother. 57, 1391-1398 (2008).
  8. Stern, J. B., Smith, K. A. Interleukin-2 induction of T-cell G1 progression and c-myb expression. Science. 233, 203-206 (1986).
  9. Kittipatarin, C., Khaled, A. R. ex vivo expansion of memory CD8 T cells from lymph nodes or spleen through in vitro culture with interleukin-7. J Immunol Methods. 344, 45-57 (2009).
  10. Kokaji, A. I., Hockley, D. L., Kane, K. P. IL-15 transpresentation augments CD8+ T cell activation and is required for optimal recall responses by central memory CD8+ T cells. J Immunol. 180, 4391-4401 (2008).
  11. Le, H. K., Graham, L., Miller, C. H., Kmieciak, M., Manjili, M. H., Bear, H. D. Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1 + ionomycin in IL-7 + IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2. Cancer Immunol Immunother. 58, 1565-1576 (2009).
Bryostatin 1/Ionomycin Yoluyla Tümör-reaktif T hücrelerinin <em>ex vivo</em> Genişleme ve Ortak Gama Zinciri Sitokinler Formülasyon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).More

Kmieciak, M., Toor, A., Graham, L., Bear, H. D., Manjili, M. H. Ex vivo Expansion of Tumor-reactive T Cells by Means of Bryostatin 1/Ionomycin and the Common Gamma Chain Cytokines Formulation. J. Vis. Exp. (47), e2381, doi:10.3791/2381 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter