Microdissection de Black Widow Soie d'araignée des glandes productrices

Summary

Nous décrivons ici une stratégie efficace pour enlever les glandes produisant la soie de l'abdomen des femelles veuves noires. Cette procédure permet l'isolement rapide de la production de soie sept glandes distinctes d'une manière hautement purifiée, un processus important pour les enquêteurs étudient la production de soie d'araignée et de l'assemblage de fibres.

Abstract

Araignées modernes tour des fibres de soie de haute performance avec une large gamme de fonctions biologiques, y compris la locomotion, la proie saisie et la protection de développer ^1,2 progéniture. Araignées accomplir ces tâches en faisant tourner plusieurs types de fibres distinctes qui ont diverses propriétés mécaniques. Une telle spécialisation des types de fibres a eu lieu à travers l'évolution des différentes glandes productrices de soie, qui fonctionnent comme des bio-usines de petite taille. Ces bio-usines de fabrication et de stocker de grandes quantités de protéines de soie pour la production de fibres. Grâce à une série complexe d'événements biochimiques, ces protéines de soie sont convertis à partir d'un liquide dans un matériau solide lors de l'extrusion.

Des études ont démontré que mécanique soies d'araignée sont plus forts que l'acier à haute résistance ^3. Analyses de comprendre la relation entre la structure et la fonction des fils de soie d'araignée ont révélé que la soie d'araignée se compose essentiellement de protéines, ou fibroins, qui ont dans leurs répète bloc de séquences de protéines ^4. Commune signatures moléculaires qui contribuent à la résistance à la traction incroyable et l'extensibilité de la soie d'araignée sont démêlé au travers des analyses d'ADNc de soie traduits. Etant donné les propriétés du matériau extraordinaire de soies d'araignée, les laboratoires de recherche à travers le monde font la course à comprendre et à imiter les processus de filage pour produire des fibres de soie synthétique pour des applications commerciales, militaires et industriels. Un des principaux défis à la filature de la soie d'araignée artificielle dans le laboratoire de recherche implique une compréhension complète des processus biochimiques qui se produisent lors de l'extrusion des fibres provenant des glandes de soie producteurs.

Nous présentons ici une méthode pour l'isolement des sept producteurs de soie différentes glandes de l'araignée veuve noire cobweaving, qui comprend les glandes ampullate majeurs et mineurs [fabrique de soie et d'échafaudages dragline] ^5,6, tubuliform [synthétise la soie cas d'œuf] ^{7 , 8,} flagelliformes [fonction inconnue en torchis-tisserands], granulats [rend la soie colle], acinus [emballage proies synthétise et les discussions à oeufs] ⁹ et piriformes [produit l'attachement de la soie disque] ^10. Cette approche est basée sur anesthésier l'araignée avec du gaz de dioxyde de carbone, la séparation ultérieure du céphalothorax de l'abdomen, et microdissection de l'abdomen afin d'obtenir les glandes produisant la soie. Après la séparation des différentes glandes productrices de soie, ces tissus peuvent être utilisés pour récupérer des macromolécules différentes pour différentes analyses biochimiques, y compris quantitative PCR en temps réel, dans le nord-ouest et le buvard, spectrométrie de masse (MS ou MS / MS) des analyses pour identifier nouvelles séquences de protéines de soie, la recherche de protéines qui participent à la voie d'assemblage de soie, ou utiliser les tissus intacts pour la culture cellulaire ou d'expériences histologiques.

Protocol

1. Anesthésier l'araignée et l'isolement de l'abdomen

1. Transfert de l'araignée d'un bocal en verre dans une boîte en carton doublée de plastique (figure 1A). Nous recueillons généralement araignées de tas de bois, des garages ou des buissons et les loger dans le laboratoire dans des bocaux en verre. Parce que l'araignée ne peut pas monter le revêtement en plastique, elle fournit une méthode efficace pour le transfert de l'araignée à partir d'un bocal en verre ou un café dans un petit peut flacon à des fins d'anesthésier. Alors que la manipulation de l'araignée à ce stade, vous devriez porter deux paires de gants en latex ou des gants de jardinage pour des raisons de sécurité.
2. Alors que l'araignée est dans la boîte de doublés de plastique, l'approche de l'araignée de son dos et de laisser la lame d'araignée dans le flacon de culture en plastique. Après l'araignée pénètre dans le flacon, placer immédiatement la fiche sur le dessus (figure 1B). Nous vous recommandons d'utiliser un flacon qui est d'environ 101,6 mm x 31,75 mm (L x P). Cela réduit la quantité de dioxyde de carbone nécessaire pour l'étape d'anesthésier.
3. Anesthetize l'araignée en introduisant du gaz dioxyde de carbone à 5-10 livres par pouce carré pendant 10 min (figure 1C). Cette quantité de gaz ne frappez l'araignée pendant environ 5 min, donc après l'anesthésie, vous devez immédiatement procéder aux étapes 1.4 à 1.5.
4. Placez l'araignée anesthésiés dans un plat à la dissection de petits et de l'utilisation des forceps pour la position de l'araignée jusqu'à côté dorsal (sablier rouge vers le bas).
5. Fixez le pédoncule (tige étroit reliant le céphalothorax et l'abdomen) pour libérer l'abdomen du reste de l'araignée (figure 1D). Stocker le céphalothorax dans le congélateur une nuit dans une boîte de Pétri et jeter après gelé le lendemain. Soyez prudent lorsque vous déplacez le céphalothorax que les crocs de l'araignée sont présents sur ce segment.
6. Fixez l'abdomen pour le matériel Sylgard dans le plat de dissection petite aide d'une épingle seul insecte. Insérer la broche d'insectes à travers le trou fait par la coupure de pédoncule (figure 1E). Cela peut facilement être identifié comme le site où le fluide sort de l'écrêtage du pédoncule. Assurez-vous de la filière (extrémité opposée du pédoncule) est orientée vers le bas (proche de chez vous).

2. Suppression de l'exosquelette

1. Faire la première incision grâce à l'exosquelette utilisant une paire de microciseaux, en commençant par le trou à partir de la coupure de pédicelle. Couper latéralement jusqu'à la face dorsale est atteint sur les deux côtés (figure 1F). En utilisant une paire de pinces, peler le segment antérieur et exosquelette insérer une seconde broche à cet endroit. Après l'insertion du second axe, tourner le plateau de dissection caudalement (angle de 90 °) de la coupe latérale initiale et continue jusqu'à ce que la découpe filières sont atteint (figure 1G). Cette incision sera perpendiculaire ou verticale pour la première coupe latérale. Ne pas couper à travers les filières où l'incision verticale est faite (par rapport postérieur à la sablier et elle a un aspect circulaire). Le défaut d'insérer les broches seconde se traduira dans l'abdomen de tourner quand les incisions verticales sont réalisées.
2. Immerger l'abdomen à disséquer une solution tampon (0,1 M de chlorure de sodium, 0,015 M citrate de sodium, 0,1% de diéthyle pyrocarbonate).
3. Peler l'exosquelette reste en arrière à partir de l'initiale, incision latérale. Lorsque cela est terminé, le tissu adipeux doit être clairement visible (figure 1H).

3. Isolement des glandes produisant la soie

1. En utilisant une pince commencer à démêler l'écart de la couche de graisse (figure 1H). La graisse aura une couleur blanchâtre à l'aspect jaunâtre. Continuez jusqu'à ce que la plupart des graisses est enlevé et les glandes de soie sont clairement visibles. La glande tubuliform se compose de trois paires de très longues, des tubes cylindriques qui sont abondants dans la cavité abdominale. Le ampullate majeur, qui se trouve dans les paires, est une ampoule grand croissant, en forme avec une longue queue distaux et un conduit proximale qui diminue de largeur à l'approche de filières de l'araignée. Le ampullate mineur est très similaire en morphologie à l'ampullate majeur, mais il est nettement plus petit. La glande flagelliformes, également en paires, est ronde et multilobulaire avec une petite cylindriques en zig-zag conduit qui s'étend vers le bas vers les filières. La glande totale (en paires) est un très grand, la glande multilobulaire qui a un canal excréteur très important qui a de grands lobes irréguliers sur elle. Les glandes acinus se produisent en grand nombre et ressemblent à court, projections fingerlike petits. La glande piriforme est la plus petite glande située dans l'abdomen et a beaucoup compacté, conduits cylindriques qui ressemblent à un ventilateur avec de nombreux petits canaux excréteurs qui s'étendent jusque dans les filières.
2. Nous vous conseillons de retirer les glandes dans l'ordre suivant: tubuliform, ampullate majeur, flagelliformes, ampullate mineur, globalement, acinus, et ensuite le piriformes (Figure 2A-B).
3. En commençant par le tubuliform, taquiner ces glandes hors du reste de l'eglandes e - ils doivent être assis sur le dessus des autres glandes (figure 2A). Il ya trois paires de glandes tubuliform dans une araignée unique. Permettez-leur de flottement libre, mais restent attachés à leurs filières par leurs conduits.
4. Ensuite, l'écart taquiner les glandes ampullate majeur. Il ya deux glandes ampullate majeurs présents dans une araignée. Pendant la procédure de retrait, assurez-vous les gaines restent attachés à des glandes (figure 2A).
5. Continuer à taquiner le reste de la glande loin les uns des autres, à travailler avec soin pour éviter toute perforation de la glande, en particulier l'agrégat et les glandes flagelliformes. Chaque glande devrait être libre flottante tout le chemin à son point de sortie dans l'exosquelette pour les filières. Ces glandes sont également trouvés dans les paires. Retirez chaque glande en pinçant le conduit avec une pince et tirant doucement jusqu'à ce qu'elle se détache du point de sortie. Le ampullate majeur, flagelliformes, ampullate mineur, et les glandes agrégées sont trouvés dans les paires. Les glandes piriformes acinus et se produisent dans de nombreuses paires de plus.
6. Retirez chaque glande en pinçant le conduit avec une pince et tirant doucement jusqu'à ce qu'elle se détache du point de sortie par la filière. Nous stockent généralement les glandes humides, cependant, nous n'ajoutons pas de tampon supplémentaire.
7. Comme les glandes sont supprimés, les placer dans stériles pré-étiquetées 1,5 ml microtubes. Glandes individuels sont présentés dans la figure 3A-G. Conservez ces glandes sur la glace, puis les congeler éclair dans l'azote liquide. Suite à la congélation instantanée dans l'azote liquide, placez-les à -80 ° C pour le stockage.

4. Les résultats représentatifs

Lors de la suppression des glandes différentes, un soin extrême doit être pris pendant la manipulation du flagelliformes et les glandes agrégées, comme ces deux structures peuvent être facilement perforés et endommagé avec la pince. Par ailleurs, il est à noter que les glandes morphologiquement flagelliformes et d'agrégat sont très similaires avant leur retrait et ils sont souvent étroitement liés les uns aux autres. Pour prévenir la contamination croisée de ces tissus lors de l'enlèvement, le dissecteur devrait soigneusement taquiner ces structures à part. De plus, lors de l'exposition initiale de la production de soie glandes, les glandes et les acinus piriformes sera le plus difficile à visualiser immédiatement en raison de leur petite taille et la localisation anatomique. Souvent, il ya la présence de nombreux œufs. Par ailleurs, des précautions supplémentaires doivent être prises lors de l'enlèvement de la glande pyriforme, que ce tissu est extrêmement collante et adhèrent souvent à votre pince. Lorsque cette procédure est faite correctement, il est possible d'obtenir les sept glandes productrices de soie d'une araignée seule manière hautement purifié. Typiquement, on peut récupérer des quantités de microgramme d'ARN total et de protéines à partir d'une dissection d'araignée unique. Un exemple d'utilisation de l'ARN total pour qPCR à examiner les taux d'ARNm d'un gène tubuliform restreint fibroïne, TuSp1, est illustré (Figure 4). Représentant des expériences qui impliquent des protéines de lysats recueillis par les glandes, par exemple en solution de digestion tryptique suivie par MS analyse (pourrait aussi être utilisé pour MS / MS) ou une analyse d'acides aminés composition est indiquée (figure 5-6, respectivement).

Figure 1. Manutention, anesthésiant, et le retrait de l'exosquelette de l'abdomen d'une araignée veuve noire femelle. A) Transfert de l'araignée dans une boîte en carton doublé de plastique pour faciliter le déplacement de l'araignée dans un flacon en plastique plus petites. B) Spider placé dans un flacon en plastique avec bouchon. C) L'anesthésie de l'araignée avec du gaz de dioxyde de carbone. D) la séparation du céphalothorax de l'abdomen à l'aide microciseaux. E) Immobilisation de l'abdomen dans le plateau de dissection utilisant des broches d'insectes. F) Voir, après une incision latérale est faite avec des ciseaux et une partie de l'exosquelette est abrogé retour avec une pince. G) Les incisions faites perpendiculairement à la première coupe latérale. H) la révocation de l'exosquelette et l'exposition de la couche de graisse.

Figure 2. Visualisation des sept différentes glandes productrices de soie tandis intacte dans l'abdomen de l'araignée ainsi que les tissus environnants. A) Images de la tubuliform, ampullate majeur, flagelliformes, globalement, les tissus ampullate mineure à un grossissement de 12X. B) l'image de l'acinus et les glandes piriformes à un grossissement de 12X.

Photographies Figure 3. Des sept soie glandes productrices après leur retrait de l'abdomen. Toutes les images ont été capturées à un grossissement de 20x à l'exception de l'acinus et les glandes piriformes, qui ont été fait à 40X. Un important)ampullate glande; B) ampullate majeurs et mineurs (côté droit) pour comparaison de taille; C) tubuliform; D) flagelliformes; E) des agrégats; F) acinus; G) piriforme.

Les résultats représentatifs Figure 4. Du patron d'expression du gène de la soie, TuSp1, après l'arpentage de la TuSp1 les niveaux d'ARNm dans les différents soie glandes productrices (hors de la glande piriformes) à l'aide quantitative PCR en temps réel (qPCR) isolement suivantes de l'ARN total à partir les glandes.

Figure 5. Exemple d'analyse de MS d'extraits protéiques obtenus à partir de la glande piriformes suivants en solution de digestion tryptique. Remarque: x2 représente deux fois de grossissement de l'intensité du spectre. Messes spectre des ions peptidiques qui correspondent aux régions de la fibroïne PySp1 sont affichés avec le symbole #.

Figure 6. Résultat typique du profil de composition en acides aminés des protéines extraites de la glande tubuliform. Remarque: ASX = Asp et Asn; GLX = Glu et Gin. Coloration bleue reflète acides aminés avec des groupes polaires chaîne latérale tandis coloration rouge représente les résidus d'acides aminés avec des groupes non polaires chaîne latérale.

Discussion

Notre méthodologie pour la microdissection des glandes produisant la soie de l'araignée veuve noire offre un moyen efficace d'obtenir hautement purifiées de la soie des glandes productrices. Les dissections peuvent être complétés dans 1,5 à 3 heures, ce qui donne un ensemble complet de sept distincts de soie des glandes productrices d'cobweavers. Obtention hautement purifiées de la soie de la glande échantillons permet aux enquêteurs la possibilité d'effectuer un large éventail d'études biochimiques, y compris l'identification de soie ou de nouvelles protéines chaperons stockées dans le contenu luminal glandulaires en utilisant la spectrométrie de masse, l'analyse des taux d'ARNm des gènes exprimés dans les glandes sélective différents , et en cultivant des glandes spécifiques in vitro pour étudier le mécanisme de production de la soie.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	SX0420-1	0.1 M in water
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758 - 5 ml	0.1% v/v
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804 - 1 kg	0.015 M in water
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software - Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments, Inc.	500260
Stainless steel forceps	World Precision Instruments, Inc.	501764	Mini Dumont #M5S
Insect pins	Indigo Instruments	33414-2	Insect pins #2
Small or large dissection dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S or DD-90-S	52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm
Drosophila culture vials	Carolina Biological	FR-17-3076	Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm