काली विधवा मकड़ी सिल्क उत्पादन ग्रंथियों के Microdissection

Summary

यहाँ हम एक कुशल महिला काले विधवा मकड़ियों के पेट से रेशम उत्पादन ग्रंथियों को निकालने की रणनीति का वर्णन. इस प्रक्रिया में सात अलग - रेशम उत्पादन एक उच्च शुद्ध फैशन, मकड़ी सिल्क उत्पादन और फाइबर विधानसभा का अध्ययन जांचकर्ताओं के लिए एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया में ग्रंथियों का तेजी से अलगाव की अनुमति देता है.

Protocol

1. मकड़ी और पेट के अलगाव Anesthetizing

1. प्लास्टिक (चित्रा 1 ए) के साथ पंक्तिवाला एक गत्ता बॉक्स में एक ग्लास जार से मकड़ी स्थानांतरण. हम आम तौर पर woodpiles, गैरेज, या झाड़ियों से मकड़ियों इकट्ठा करने और उन्हें प्रयोगशाला में कांच के जार में घर. क्योंकि मकड़ी प्लास्टिक की परत नहीं चढ़ाई कर सकते हैं, यह एक कुशल anesthetizing प्रयोजनों के लिए एक छोटी शीशी में से एक गिलास जार या कॉफी कर सकते हैं मकड़ी हस्तांतरण विधि प्रदान करता है. जबकि इस बिंदु पर मकड़ी से निपटने, आप लाटेकस दस्ताने या सुरक्षा उद्देश्यों के लिए बागवानी दस्ताने के दो जोड़े पहने किया जाना चाहिए.
2. जबकि मकड़ी बॉक्स में प्लास्टिक के साथ लाइन है, अपनी पीठ से मकड़ी दृष्टिकोण और प्लास्टिक की संस्कृति शीशी में मकड़ी स्लाइड. बाद मकड़ी शीशी में प्रवेश करती है, शीर्ष (चित्रा 1 बी) पर तुरंत प्लग जगह है. हम एक शीशी है कि लगभग 101.6 x 31.75 मिमी (एल एक्स डी) मिमी है का उपयोग करने की अनुशंसा. यह कार्बन डाइऑक्साइड गैस के anesthetizing कदम के लिए आवश्यक राशि कम से कम.
3. वर्ग इंच प्रति 5-10 पाउंड में 10 मिनट (चित्रा 1C) के लिए कार्बन डाइऑक्साइड गैस शुरू करने से मकड़ी anesthetize. गैस की यह राशि केवल मकड़ी बाहर दस्तक लगभग 5 मिनट के लिए, तो anesthetization बाद आप तुरंत 1.4-1.5 कदम आगे बढ़ना चाहिए.
4. एक छोटे से विच्छेदन डिश में anesthetized मकड़ी प्लेस और संदंश का उपयोग करने के लिए मकड़ी पृष्ठीय पक्ष अप (लाल hourglass नीचे का सामना करना पड़ रहा है) की स्थिति.
5. क्लिप डंडी (संकीर्ण cephalothorax और पेट को जोड़ने डंठल) मकड़ी के बाकी (चित्रा 1D) से पेट जारी है. एक पेट्री डिश में रात भर फ्रीजर में cephalothorax स्टोर और त्यागने के बाद अगले दिन जमे हुए. सावधान रहो, जब cephalothorax चलती है के रूप में मकड़ी के नुकीले इस खंड पर मौजूद हैं.
6. छोटे विच्छेदन पकवान में Sylgard सामग्री एक एकल कीट पिन का उपयोग करने के लिए पेट जकड़ना. डंठल क्लिपिंग (चित्रा 1E) से बने छेद के माध्यम से कीट पिन डालें. यह आसानी से जहां द्रव डंडी की कतरन से उभर रहा है साइट के रूप में पहचाना जा सकता है है. सुनिश्चित करें कि spinneret (डंठल के विपरीत अंत) के नीचे की ओर उन्मुख है (आप के लिए निकटतम).

2. Exoskeleton का हटाया

1. Microscissors की एक जोड़ी का उपयोग exoskeleton के माध्यम से पहली चीरा, डंडी कतरन से छेद में शुरू. Laterally कट जब तक पृष्ठीय पक्ष पर दोनों पक्षों (चित्रा 1F) तक पहुँच जाता है. संदंश की एक जोड़ी का उपयोग, वापस पूर्वकाल exoskeleton खंड छील और इस स्थान पर एक दूसरे पिन डालने. दूसरे पिन के सम्मिलन के बाद, प्रारंभिक पार्श्व कटौती से विदारक caudally ट्रे (90 ° कोण) की बारी है और काटने जब तक spinnerets पहुँच रहे हैं (चित्रा 1G) जारी है. यह चीरा सीधा या अनुलंब प्रारंभिक पार्श्व कटौती के लिए किया जाएगा. Spinnerets जब ऊर्ध्वाधर चीरा किया जाता है (hourglass करने के लिए पीछे रिश्तेदार है और यह एक परिपत्र उपस्थिति है) के माध्यम से काट मत करो. दूसरा पिन सम्मिलित करने में विफलता कताई जब ऊर्ध्वाधर चीरों प्रदर्शन कर रहे हैं पेट में परिणाम देगा.
2. डूब समाधान बफर (0.1 एम सोडियम क्लोराइड, 0.015 एम सोडियम साइट्रेट, Pyrocarbonate Diethyl 0.1%) विदारक में पेट.
3. शेष exoskeleton पील वापस प्रारंभिक, पार्श्व चीरा से शुरू. जब यह पूरा हो गया है, वसा ऊतकों स्पष्ट रूप से दिखाई जानी चाहिए (1h के चित्रा).

3. रेशम उत्पादन ग्रंथियों के अलगाव

1. का प्रयोग संदंश दूर मोटी परत (1h के चित्रा) चिढ़ा शुरू करते हैं. वसा पीले उपस्थिति के लिए एक सफेद होगा. जारी रखें जब तक वसा की सबसे हटा दिया है और रेशम ग्रंथियों को स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. tubuliform ग्रंथि बहुत लंबे समय है, बेलनाकार ट्यूब है कि उदर गुहा में प्रचुर मात्रा में हैं के तीन जोड़े के होते हैं. प्रमुख ampullate, जो जोड़े में पाया जाता है एक लंबी जटिल डिस्टल पूंछ और एक प्रॉक्सिमल वाहिनी है कि चौड़ाई में घटने के रूप में यह मकड़ी spinnerets दृष्टिकोण के साथ एक बड़े, अर्द्ध चंद्राकार आकार ampulla है. मामूली ampullate प्रमुख ampullate के लिए आकारिकी में बहुत समान है, लेकिन यह काफी छोटी है. flagelliform ग्रंथि भी जोड़ों में होने वाली है, गोल और एक छोटे वाहिनी कि spinnerets ओर नीचे फैली zig-zag बेलनाकार साथ multilobular है. कुल ग्रंथि (जोड़े में पाया) एक बहुत बड़ी, multilobular ग्रंथि है कि एक बहुत बड़ी निकालनेवाला नाला है जो उस पर बड़े, अनियमित lobes है है. aciniform ग्रंथियों बड़ी संख्या में पाए जाते हैं और लघु, छोटे fingerlike अनुमानों सदृश. pyriform ग्रंथि पेट में छोटी ग्रंथि है और कई जमा है, बेलनाकार नलिकाओं है कि कई छोटे निकालनेवाला नलिकाओं है कि spinnerets करने के लिए नीचे का विस्तार के साथ एक प्रशंसक के समान है.
2. हम निम्नलिखित क्रम में ग्रंथियों को हटाने की सिफारिश: tubuliform, प्रमुख ampullate, flagelliform, मामूली ampullate, समग्र, aciniform, और तब pyriform (बी चित्रा - 2A).
3. Tubuliform शुरुआत के साथ, इन ग्रंथियों वीं के बाकी के बंद तंगई ग्रंथियों - वे अन्य ग्रंथियों (2A चित्रा) के शीर्ष पर बैठे होना चाहिए. वहाँ एक एकल मकड़ी में तीन tubuliform ग्रंथियों के जोड़े हैं. उन्हें मुक्त फ्लोट करने की, लेकिन उनके नलिकाओं द्वारा उनके spinnerets करने के लिए संलग्न रहने की अनुमति दें.
4. अगला, दूर प्रमुख ampullate ग्रंथियों तंग. वहाँ दो प्रमुख ampullate एक मकड़ी में मौजूद ग्रंथियों हैं. हटाने की प्रक्रिया के दौरान, सुनिश्चित करें कि नलिकाओं ग्रंथियों (2A चित्रा) के लिए संलग्न रहते हैं.
5. ग्रंथियों के बाकी एक दूसरे से दूर तंग, ध्यान से काम करने के लिए ग्रंथियों के किसी puncturing, विशेष रूप से समग्र और flagelliform ग्रंथियों से बचने के लिए आगे बढ़ें. प्रत्येक ग्रंथि मुक्त हो spinnerets के लिए exoskeleton में अपनी बाहर निकलने के बिंदु करने के लिए सभी तरह तैर चाहिए. इन ग्रंथियों को भी जोड़े में पाए जाते हैं. संदंश के साथ वाहिनी बन्द रखो और ध्यान से जब तक इसे बाहर निकलने के बिंदु से दूर टूट जाता है खींच द्वारा प्रत्येक ग्रंथि निकालें. प्रमुख ampullate, flagelliform, मामूली ampullate, और कुल ग्रंथियों जोड़े में पाए जाते हैं. aciniform और pyriform ग्रंथियों कई और अधिक जोड़े में होते हैं.
6. संदंश के साथ वाहिनी बन्द रखो और ध्यान से खींच जब तक इसे बाहर निकलने के बिंदु से दूर spinneret द्वारा टूट जाती है प्रत्येक ग्रंथि निकालें. हम आम तौर पर ग्रंथियों गीला दुकान, तथापि, हम अतिरिक्त बफर जोड़ नहीं है.
7. के रूप में ग्रंथियों को हटा रहे हैं, उन्हें बाँझ पूर्व लेबल 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में जगह है. व्यक्तिगत ग्रंथियों 3A जी चित्रा में दिखाए जाते हैं. इन ग्रंथियों को बर्फ पर रखें और तब फ़्लैश उन्हें तरल नाइट्रोजन में फ्रीज. तरल नाइट्रोजन में फ़्लैश ठंड के बाद, उन्हें -80 में जगह ° C भंडारण के लिए.

4. प्रतिनिधि परिणाम

जब अलग ग्रंथियों को हटाने, चरम देखभाल जबकि flagelliform और कुल ग्रंथियों संभाल लिया होना चाहिए, के रूप में इन दो संरचनाओं को आसानी से हो सकता है और पंचर कर सकते हैं संदंश के साथ क्षतिग्रस्त. इसके अलावा, यह देखते हुए कि आकृति विज्ञान flagelliform और सामूहिक ग्रंथियों बहुत उनके हटाने के लिए पहले समान लग रही है और वे अक्सर एक दूसरे के साथ intertwined रहे हैं लायक है. हटाने पर इन ऊतकों के पार संदूषण को रोकने के लिए, चीड़फाड़ करनेवाला ध्यान से इन संरचनाओं के अलावा तंग चाहिए. इसके अतिरिक्त, रेशम उत्पादन ग्रंथियों के प्रारंभिक निवेश पर, aciniform और pyriform ग्रंथियों सबसे करने के लिए तुरंत अपने छोटे आकार और संरचनात्मक स्थान की वजह से कल्पना करना मुश्किल हो जाएगा. अक्सर वहाँ कई अंडे की उपस्थिति है. इसके अलावा, अतिरिक्त देखभाल करने के लिए जब pyriform ग्रंथि को दूर किए जाने की जरूरत है, के रूप में इस ऊतक बहुत चिपचिपा है और अक्सर अपने संदंश का पालन करना होगा. जब यह प्रक्रिया ठीक से किया है, यह संभव है एक उच्च शुद्ध तरीके से एक एक मकड़ी से सभी सात रेशम उत्पादन ग्रंथियों प्राप्त है. आमतौर पर, एक एक एकल मकड़ी विच्छेदन से कुल शाही सेना और प्रोटीन की माइक्रोग्राम मात्रा को ठीक कर सकते हैं. QPCR के लिए कुल शाही सेना का उपयोग करने के लिए tubuliform प्रतिबंधित फ़ाइब्राइन जीन, TuSp1 mRNA स्तर की जांच के एक उदाहरण के लिए, दिखाया गया है (चित्रा 4). प्रतिनिधि प्रयोगों शामिल है कि प्रोटीन ग्रंथियों से एकत्र lysates समाधान tryptic एमएस विश्लेषण (एमएस / एमएस विश्लेषण के लिए भी इस्तेमाल किया जा सकता है) या एक एमिनो एसिड संरचना विश्लेषण दिखाया जाता है (5-6 चित्रा, क्रमशः) द्वारा पीछा पाचन जैसे.

चित्रा 1. हैंडलिंग, anesthetizing, और exoskeleton की एक महिला काली विधवा मकड़ी के पेट से हटाने. ए) एक छोटे प्लास्टिक की शीशी में मकड़ी चलती की सुविधा के लिए प्लास्टिक के साथ पंक्तिवाला एक गत्ता बॉक्स में मकड़ी का स्थानांतरण. बी) स्पाइडर प्लग के साथ एक प्लास्टिक की शीशी में रखा. सी) कार्बन डाइऑक्साइड गैस के साथ मकड़ी Anesthetizing. डी) microscissors का उपयोग पेट से cephalothorax के पृथक्करण. ई) विदारक कीट पिन का उपयोग कर ट्रे में पेट के स्थिरीकरण. देखें एफ) के बाद एक पार्श्व चीरा कैंची और exoskeleton के एक हिस्से को संदंश के साथ वापस pealed के साथ किया जाता है. जी) चीरों सीधा प्रारंभिक पार्श्व में कटौती करने के लिए बनाया जा रहा है. एच) exoskeleton और मोटी परत के जोखिम के निकालना.

चित्रा 2 सात विभिन्न रेशम उत्पादक जबकि मकड़ी के रूप में के रूप में अच्छी तरह से आसपास के ऊतकों के पेट में बरकरार ग्रंथियों के विज़ुअलाइज़ेशन. ए) tubuliform की छवियाँ, प्रमुख ampullate, flagelliform, कुल, 12X बढ़ाई मामूली ampullate ऊतकों. बी) 12X आवर्धन पर aciniform और pyriform ग्रंथियों की छवि.

उनके पेट से हटाने के बाद सात रेशम उत्पादन ग्रंथियों की फोटो चित्रा 3 . सभी छवियों aciniform और pyriform ग्रंथियों, जो 40x पर किया गया था के अपवाद के साथ 20X आवर्धन पर कब्जा कर लिया गया. ए) प्रमुखampullate ग्रंथि, बी) के आकार तुलना के लिए मुख्य और लघु (सही पक्ष) ampullate, सी) tubuliform, डी) flagelliform, ई) कुल, एफ) aciniform; pyriform जी).

चित्रा 4 जीन रेशम, TuSp1 विभिन्न रेशम उत्पादन ग्रंथियों में TuSp1 mRNA स्तर के सर्वेक्षण के बाद, (pyriform ग्रंथि को छोड़कर) से मात्रात्मक वास्तविक समय पीसीआर (qPCR) कुल शाही सेना के निम्नलिखित अलगाव का उपयोग की अभिव्यक्ति पैटर्न के प्रतिनिधि के परिणाम ग्रंथियों.

चित्रा 5 प्रोटीन समाधान tryptic पाचन के बाद pyriform ग्रंथि से प्राप्त अर्क के एमएस विश्लेषण के उदाहरण . नोट: x2 स्पेक्ट्रम तीव्रता के 2 गुना बढ़ाई का प्रतिनिधित्व करता है. स्पेक्ट्रम पेप्टाइड आयन जनता है कि PySp1 फ़ाइब्राइन के क्षेत्रों के अनुरूप # प्रतीक के साथ दिखाए जाते हैं.

चित्रा 6 tubuliform ग्रंथि से निकाले प्रोटीन के एमिनो एसिड संरचना प्रोफ़ाइल के विशिष्ट परिणाम है . नोट: ASX = Asp और Asn, GLX = ग्लू और GLN. ब्लू रंगाई ध्रुवीय पक्ष श्रृंखला समूहों के साथ अमीनो एसिड को दर्शाता है, जबकि लाल रंगाई गैर ध्रुवीय पक्ष श्रृंखला समूहों के साथ अमीनो एसिड के अवशेष का प्रतिनिधित्व करता है.

Discussion

काली विधवा मकड़ी से रेशम उत्पादन ग्रंथियों के microdissection के लिए हमारी पद्धति उच्च शुद्ध रेशम उत्पादन ग्रंथियों प्राप्त करने के लिए एक प्रभावी का मतलब है प्रदान करता है. Dissections 1.5 से 3 घंटे में पूरा किया जा सकता है, सात अलग का एक पूरा सेट रेशम उत्पादन cobweavers से ग्रंथियों की उपज है. उच्च शुद्ध रेशम ग्रंथि के नमूने प्राप्त करने जांचकर्ताओं नए रेशम या निगरानी प्रोटीन ग्रंथियों luminal सामग्री के भीतर विभिन्न ग्रंथियों में चुनिंदा व्यक्त जीनों के लिए जन, mRNA स्तर के स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके संग्रहीत की पहचान सहित जैव रासायनिक अध्ययन का एक व्यापक रेंज प्रदर्शन करने की क्षमता देता है , और इन विट्रो में विशिष्ट ग्रंथियों के संवर्धन के लिए रेशम उत्पादन के तंत्र का अध्ययन .

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium chloride	Electron Microscopy Sciences	SX0420-1	0.1 M in water
Diethyl pyrocarbonate	Sigma-Aldrich	D-5758 - 5 ml	0.1% v/v
Sodium citrate	Sigma-Aldrich	S1804 - 1 kg	0.015 M in water
Dissecting microscope	Leica Microsystems	Leica MZ16
Digital microscope camera	Leica Microsystems	DFC320	Software - Leica Application Suite v2.8.1
Vannas scissors	World Precision Instruments, Inc.	500260
Stainless steel forceps	World Precision Instruments, Inc.	501764	Mini Dumont #M5S
Insect pins	Indigo Instruments	33414-2	Insect pins #2
Small or large dissection dishes	Living Systems Instrumentation	DD-50-S or DD-90-S	52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm
Drosophila culture vials	Carolina Biological	FR-17-3076	Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm