Summary
Burada kadın kara dul örümcekleri karın ipek üreten bezlerin kaldırmak için etkili bir strateji açıklanmaktadır. Bu prosedür, yedi ayrı ipek üreten, son derece saf bir moda, örümcek ipeği üretimi ve lif montaj inceleyen araştırmacılar için önemli bir süreci bezlerinin hızlı bir izolasyon sağlar.
Abstract
Modern örümcekler, biyolojik fonksiyonları, hareket, avlarını yakalamak ve gelişmekte olan yavrular 1,2 korunması da dahil olmak üzere geniş bir yelpazede yüksek performanslı ipek lifleri dönerler. Örümcekler farklı mekanik özelliklere sahip birkaç farklı fiber türleri iplik bu görevleri yerine getirmek. Bu tür uzmanlık elyaf türleri küçük biofactories olarak işlev farklı ipek üreten bezleri, evrimle meydana gelmiştir. Bu biofactories üretimi ve elyaf üretimi için ipek proteinleri büyük miktarlarda saklamak. Biyokimyasal olayların karmaşık bir dizi sayesinde, bu ipek proteinleri ekstrüzyon üzerine sağlam bir malzeme bir sıvı haline dönüştürülür.
Mekanik çalışmalar örümcek ipek yüksek gerilimli çelik 3 daha güçlü olduğunu göstermiştir. Analizler örümcek ipek ipler yapı ve fonksiyon arasındaki ilişkiyi anlamak için, örümcek ipeği, büyük ölçüde onların protein dizileri içinde 4 blok tekrarlar proteinler, ya da fibroins ibaret olduğunu ortaya koymuştur. Inanılmaz bir örümcek ipek çekme dayanımı ve genişletilebilirlik katkıda Ortak moleküler imzalar tercüme ipek cDNAs analizleri ile sökülmüş edilmektedir. Örümcek ipekler olağanüstü malzeme özellikleri göz önüne alındığında, dünya çapında araştırma laboratuarları, ticari, askeri ve endüstriyel uygulamalar için sentetik ipek lifleri iplik üretmek için süreci anlamak ve taklit etmek için yarış halindeler. Araştırma laboratuvarı yapay örümcek ipeği iplik temel güçlüklerden biri, ipek üreten bezlerin lifleri ekstrüzyon esnasında meydana gelen biyokimyasal süreçlerin tam bir anlayış içerir.
Burada yedi farklı ipek üreten bezlerin büyük ve küçük ampullate bezleri içeren cobweaving kara dul örümceğinin, 5,6, tubuliform [sentezler yumurta durumda ipek] [paletli vinç ve iskele ipek üreten] 7 izolasyonu için bir yöntem mevcut , 8, flagelliform [koçanı-dokumacılar bilinmeyen işlev] [tutkal ipek, toplam yapar] aciniform [sentezler av sarma ve yumurta durumda konuları] 9 ve piriform 10 [Ek disk ipek üretir]. Bu yaklaşım, karbondioksit gazı, karın cephalothoraksın sonraki ayırma ve ipek üreten bezlerin elde etmek için karın, mikrodiseksiyon örümcek anestezi dayanmaktadır. Farklı ipek üreten bezlerin ayrılmasını takiben, bu dokularda belirlemek için kantitatif gerçek zamanlı PCR, kuzey-ve batı blot, kütle spektrometresi (MS veya MS / MS) analizleri de dahil olmak üzere farklı biyokimyasal analizler için farklı makromoleküllerin almak için kullanılabilir yeni ipek protein dizileri, ipek montaj yolu katılırlar, ya da sağlam doku, hücre kültürü veya histolojik deneyler için kullanmak proteinleri araştırın.
Protocol
1. Karın örümcek ve izolasyon anestezi
- Plastik (Şekil 1A) ile kaplı bir karton kutunun içine bir cam kavanoz örümcek aktarın. Biz genellikle woodpiles, garajlar ya da çalılar örümcekler toplamak ve laboratuvarda cam kavanoz içinde onlara ev. Örümcek plastik astarı yukarı tırmanmak değil, çünkü bir cam kavanoz ya da kahve örümcek anestezi amaçlı küçük bir şişenin içine aktarmak için etkili bir yöntem sağlar. Bu noktada örümcek işleme, iki çift lateks eldiven veya güvenlik amaçlı bahçe eldiven giyiyor olmalıdır.
- Örümcek kutusundaki plastik ile kaplı olmasına rağmen, arka yaklaşım ve örümcek örümcek slayt, plastik kültürü şişe içine sağlar. Örümcek flakon girdikten sonra hemen üst (Şekil 1B) üzerinden fiş yerleştirin. Biz yaklaşık 101.6 mm x 31.75 mm (L x D) bir şişe kullanmanızı öneririz. Bu anestezi adım için gerekli karbon dioksit gazı miktarını en aza indirir.
- Inç kare başına 10 dakika (Şekil 1C) 5-10 kilo karbondioksit gazı getirerek örümcek anestezisi. Bu miktar sadece gaz anesthetization sonra hemen adımları 1,4-1,5 geçmemiz gereken, yaklaşık 5 dakika süreyle örümcek knock out olacak.
- Anestezi örümcek, küçük bir diseksiyon çanak içine yerleştirin ve örümcek dorsal yüzü yukarı (kırmızı kum saati aşağı bakacak şekilde) pozisyonu için forseps kullanabilir.
- Örümcek geri kalanı (Şekil 1D) karın serbest sapçık (Sefalotoraks ve karın bağlayan dar sapı) Clip. Petri geceleme dondurucu cephalothoraksın Mağaza ve ertesi gün dondurulmuş sonra atın. Örümcek kıskaçlar bulunan bu segmentte cephalothoraksın taşırken dikkatli olun.
- Tek bir böcek pin kullanarak küçük diseksiyonu çanak Sylgard malzeme karın sabitleyin. Sapçık kırpma (Şekil 1E) yapılan delikten böcek pimi takın. Bu sıvı sapçık kırpma çıkan site olarak kolayca tespit edilebilir. Düze (sapçık diğer ucunu) (size en yakın) alt yönlediriyor emin olun.
2. Exoskeleton kaldırılması
- Sapçık kırpma delik başlayan, bir microscissors çifti kullanılarak dış iskelet ile ilk kesi olun. Dorsal yüzü her iki tarafında (Şekil 1F) ulaşana kadar yanal kesin. Ön dış iskelet segmentinde kabuğu, bir çift forseps kullanma ve bu yerde ikinci bir iğne takın. Ikinci pin ekleme takiben, ilk yanal kesim kaudal diseksiyon tepsi (90 ° açı) açın ve memeciklerin (Şekil 1G) ulaşana kadar kesme devam edin. Bu kesi ilk yanal kesme dik veya dikey olacaktır. Düşey kesi yapılır memeciklerin (kum saati posterior akrabası ve dairesel bir görünüme sahiptir) ile kesmeyin. Ikinci pin eklemek için dikey insizyonlar yapılır iplik karın neden olacaktır.
- Batmak tampon solüsyonu (0.1 M Sodyum Klorür, 0.015 M Sodyum Sitrat,% 0.1 Pyrocarbonate Dietil) diseksiyon karın.
- Geri kalan dış iskelet Peel ilk yatay kesi başlayarak. Bu tamamlandığında, yağ dokusu (Şekil 1H) açıkça görünür olmalıdır.
3. Ipek üreten bezlerin izolasyonu
- Forseps kullanarak yağ tabakası (Şekil 1H) uzak alay başlar. Yağ beyazımsı ve sarımsı görünümüne sahip olacak. Çoğu yağ çıkarılır ve ipek bezleri açıkça görülebilir kadar devam edin. Tubuliform bezi, karın boşluğunda bol, çok uzun, silindirik tüpler üç çift oluşur. Çift halinde bulunan büyük ampullate, uzun dolambaçlı bir distal kuyruk ve örümcek memeciklerin yaklaşımlar olarak genişliği azalır proksimal kanalı ile büyük bir hilal şeklinde ampulla. Küçük ampullate büyük ampullate morfolojisi çok benzer, ancak önemli ölçüde küçüktür. Aynı zamanda çiftleri meydana flagelliform bezi, yuvarlak ve aşağı memeciklerin doğru uzanır kanalı zig-zag bir küçük silindirik multilobular. Toplam bezi (çift), üzerinde büyük, düzensiz lob vardır çok büyük bir boşaltım kanalı çok geniş, multilobular bezi. Aciniform bezleri çok sayıda ortaya çıkar ve kısa, küçük parmak projeksiyonları benzerler. Piriform bezi karında küçük bir bezdir ve memeciklerin aşağı uzanan birçok küçük boşaltım kanalları ile bir fan benzer birçok sıkıştırılmış, silindirik kanalları vardır.
- Piriform (Şekil 2A-B), daha sonra tubuliform, büyük ampullate flagelliform, küçük ampullate, agrega, aciniform ve: Biz aşağıdaki sırayla bezleri kaldırarak öneririz.
- Tubuliform ile başlayarak, yüzyılın geri kalanında bu bezleri kapalı kızdırmake bezleri diğer bezleri (Şekil 2A) üstüne oturuyor olmalıdır. Tek bir örümcek tubuliform bezlerinin üç çift vardır. Halka açık ama kendi kanalları kendi memeciklerin bağlı kalmasını sağlayın.
- Sonra, büyük ampullate bezleri kızdırmak. Bir örümcek bulunan iki büyük ampullate bezleri vardır. Kaldırma işlemi sırasında, kanallar bezleri (Şekil 2A) bağlı kaldığından emin olun.
- , Özellikle agrega ve flagelliform bezleri bezleri delinmesiyle önlemek için dikkatli bir şekilde çalışan, birbirinden uzakta bezlerinin geri kalanı tease devam edin. Her bezi memeciklerin Exoskeleton çıkış noktası her şekilde yüzen arındırılmış olmalıdır. Bu bezler aynı zamanda çift olarak bulunurlar. Forseps ile kanal kısma ve onu çıkış noktası tatili kadar dikkatle çekerek her bezi çıkarın. Büyük ampullate, flagelliform, küçük ampullate, ve toplam bezlerinin çiftleri bulundu. Aciniform ve piriform bezleri çok daha fazla çiftleri meydana gelir.
- Her bezi kanalı kısma ve forseps ile düze çıkış noktası aşağı uzak bozulana kadar dikkatle çekerek çıkarın. Biz genellikle bezleri ıslak saklamak, ancak ek tampon ilave etmeyiniz.
- Bezleri çıkarılır, ön etiketli steril 1,5 ml mikrosantrifüj tüpler içine yerleştirin. Bireysel bezleri Şekil 3A-G gösterilmiştir. Bu bezlerin buz üzerinde tutun ve sonra flaş sıvı nitrojen dondurma. Koyun sıvı nitrojen içinde flaş dondurma, -80 ° C depolama için.
4. Temsilcisi Sonuçlar
Flagelliform ve toplam bezlerinin işleme sırasında bu iki yapının kolayca delinmiş ve forseps ile hasar gibi farklı bezleri çıkarırken, çok dikkatli alınması gerekmektedir. Ayrıca, morfolojik flagelliform ve toplam bezleri önce kaldırılması çok benzer ve çoğu zaman birbirleri ile iç içe olduğunu fazlalaştı. Disektör dikkatle bu dokuların çıkarılması üzerine çapraz bulaşmayı önlemek için, bu yapıların dışında kızdırmak olmalıdır. Ayrıca, ilk poz ipek üreten bezlerin üzerine, aciniform ve piriform bezleri, küçük boyut ve anatomik konumu nedeniyle hemen görselleştirmek için en zor olacaktır. Genellikle çok sayıda yumurta varlığı yoktur. Ayrıca, bu doku son derece yapışkan ve forseps sık sık uyacaktır ek bakım, piriform bezi çıkarırken alınması gerekir. Bu işlem doğru yapıldığında, son derece saf bir şekilde tek bir örümcek tüm yedi ipek üreten bezlerin elde etmek mümkündür. Genellikle, bir, tek bir örümcek diseksiyonu toplam RNA ve protein mikrogram miktarlarda kurtarabilirsiniz. Tubuliform kısıtlanmış fibroin gen, TuSp1 mRNA düzeylerini incelemek için qPCR için toplam RNA kullanarak bir örnek gösterilmiştir (Şekil 4). Protein bezleri alınan lizatları içeren Temsilcisi deneyler MS analizi (MS / MS analizi için kullanılan olabilir) ya da bir amino asit kompozisyonu analizi (sırasıyla Şekil 5-6) gösterilir takip çözüm triptik sindirim gibi.
Şekil 1 Taşıma, anestezi ve dış iskelet bir kadın kara dul örümceğinin karın kaldırılması. A) örümcek, daha küçük bir plastik şişenin içine örümcek hareket kolaylaştırmak için plastik ile kaplı bir karton kutunun içine aktarın. B) Örümcek fişli bir plastik şişenin içine yerleştirilir. C) örümcek karbondioksit gazı ile etkisiz. D) Cephalothoraksın microscissors kullanarak karın ayrılması. E) böcek pimleri kullanarak diseksiyon tepsi karın İmmobilizasyon. F) makas ve dış iskelet bir kısmını forseps ile geri soyulmuş lateral kesi yapıldıktan sonra gör. G) Kesiler ilk yanal kesme dik yapılmaktadır. H) yağ tabakasının dış iskelet ve pozlama kaldırılması.
Şekil 2, örümcek gibi çevre dokulara karın dokunmamak yedi farklı ipek üreten bezlerin Görselleştirme . A) tubuliform Görüntüler, büyük ampullate flagelliform, toplam 12X büyütme, küçük ampullate dokular. B) 12X büyütme aciniform ve piriform bezleri Resim.
Şekil 3 karından çıkarılmasından sonra yedi ipek üreten bezlerin Fotoğraflar. 20X büyütme 40X az yapıldı aciniform ve piriform bezleri, istisna ile tüm görüntüler ele geçirildi. A) büyükampullate bezi B) boyut karşılaştırma için büyük ve küçük ampullate (sağ tarafı); C) tubuliform; D) flagelliform; E) agrega; F) aciniform G) piriform.
Şekil 4 toplam RNA kantitatif gerçek zamanlı PCR (qPCR) aşağıdaki izolasyon kullanarak farklı ipek üreten bezlerin TuSp1 mRNA düzeylerini ölçme sonra ipek gen TuSp1 (piriform bezi hariç) ifade desen Temsilcisi sonuçları bezlerinin.
Şekil 5 çözüm triptik sindirim aşağıdaki piriform bezinden elde edilen protein ekstreleri MS analizi örneği . Not: x2 spektrumunun 2 kat büyütme temsil eder. PySp1 fibroin bölgelere karşılık gelen Spektrum peptid iyon kitleler # sembolü ile gösterilir.
Şekil 6 tubuliform bezinden çıkarılan proteinlerin amino asit kompozisyonu profili tipik sonucudur. Not: ASX = Asp ve Asn; GLX = Glu ve Gln. Mavi rengi, kırmızı renklenme, polar olmayan yan zincir grupları ile amino asit artıkları temsil eder, oysa amino asitler polar yan zincir grupları ile yansıtır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kara dul örümceği ipek üreten bezlerin mikrodiseksiyon metodolojisi yüksek derecede saflaştırılmış ipek üreten bezlerin elde etmek için etkili bir araç sunmaktadır. Diseksiyonlarının yedi ayrı komple bir set ipek üreten bezlerin cobweavers gelen verimli 1,5 ila 3 saat içinde tamamlanabilir. Yüksek derecede saflaştırılmış ipek bezi örnekleri elde edilmesi araştırmacılar farklı bezlerinde seçici genlerin mRNA düzeyleri kütle spektrometresi, analiz kullanarak glandüler luminal içeriğini içinde depolanan yeni ipek veya hastabakıcı proteinler belirlenmesi de dahil olmak üzere geniş bir biyokimyasal çalışmalar gerçekleştirme yeteneği sağlar ve ipek üretim mekanizması çalışmada, in vitro spesifik bezleri kültür .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma, Black Widow Spider ipek bir NSF RUI Hibe MCB-0950372 başlıklı Moleküler Karakterizasyonu tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Electron Microscopy Sciences | SX0420-1 | 0.1 M in water |
| Diethyl pyrocarbonate | Sigma-Aldrich | D-5758 - 5 ml | 0.1% v/v |
| Sodium citrate | Sigma-Aldrich | S1804 - 1 kg | 0.015 M in water |
| Dissecting microscope | Leica Microsystems | Leica MZ16 | |
| Digital microscope camera | Leica Microsystems | DFC320 | Software - Leica Application Suite v2.8.1 |
| Vannas scissors | World Precision Instruments, Inc. | 500260 | |
| Stainless steel forceps | World Precision Instruments, Inc. | 501764 | Mini Dumont #M5S |
| Insect pins | Indigo Instruments | 33414-2 | Insect pins #2 |
| Small or large dissection dishes | Living Systems Instrumentation | DD-50-S or DD-90-S | 52 mm diameter x 18 mm H (Sylgard Depth ~6mm) or 93 mm x 22 mm |
| Drosophila culture vials | Carolina Biological | FR-17-3076 | Size is 31.75 mm diameter x 101.6 mm |
References
- Vollrath, F., Knight, D. P. Int. J. Biol. Macromol. 24, 243-243 (1999).
- Gosline, J. M., Guerette, P. A., Ortlepp, C. S. J. Exp. Biol. 202, 3295-3295 (1999).
- Gosline, J. M., DeMont, M. E., Denny, M. W. Endeavour. 10, 31-31 (1986).
- Hinman, M. B., Jones, J. A., Lewis, R. V. Trends Biotechnol. 18 (9), 374-374 (2000).
- Lewis, R. V., Xu, M. Proc. Natl. Acad. Sci. 87, 7120-7120 (1990).
- Colgin, M. A., Lewis, R. V. Protein Sci. 7 (3), 667-667 (1998).
- Tian, M., Lewis, R. V. Appl. Phys. A-Mater. 82, 265-265 (2006).
- Hu, X., Lawrence, B., Kohler, K. Biochemistry. 44 (30), 10020-10020 (2005).
- Vasanthavada, K., Hu, X., Falick, A. M. J Biol Chem. 282 (48), 35088-35088 (2007).
- Hayashi, C. Y., Blackledge, T. A., Lewis, R. V. Mol. Biol. Evol.. 21 (10), 1950-1950 (2004).
- Blasingame, E., Tuton-Blasingame, T., Larkin, L. J Biol Chem. 284 (42), 29097-29097 (2009).
