Summary
Protokoll som beskriver tillämpningen av ett flöde cellsystem för växande och analysera mikrobiella biofilmer för Confocal laserscanning Mikroskopi (CLSM).
Abstract
Många mikrobiella celler har förmågan att bilda fastsittande mikrobiella samhällen definieras som biofilmer som har ändrats fysiologiska och patologiska egenskaper jämfört med fritt levande mikroorganismer. Biofilmer i naturen är ofta svåra att utreda och vistas i dåligt definierade villkor 1. Med hjälp av en transparent underlag är det möjligt att enheten ett system där enkla biofilmer kan undersökas på ett icke-förstörande sätt i realtid: här har vi demonstrera montering och drift av en flödescell modellsystem, för in vitro 3D studier av mikrobiella biofilmer generera hög reproducerbarhet enligt noga fastställda villkor 2,3.
Systemet består av ett flöde cell som fungerar som tillväxt kammare för biofilmen. Flödet cellen levereras med näringsämnen och syre från ett medium kolv via en Slangpumpar och tillbringade mediet samlas upp i en avfallsbehållare. Denna konstruktion av flödet systemet tillåter en kontinuerlig tillförsel av näringsämnen och administration av t.ex. antibiotika med minimal störning av celler som odlas i flödet kammaren. Dessutom flödesförhållanden inom flödescellen möjliggör studier av biofilm utsätts för skjuvspänning. En bubbla fånga anordning begränsar luftbubblor från slangen som annars kan störa biofilmen struktur i flödet cellen.
Flödet cellen systemet är kompatibelt med Confocal laserscanning Mikroskopi (CLSM) och kan därmed ge mycket detaljerad 3D-information om att utveckla mikrobiella biofilmer. Celler i biofilmen kan vara märkt med fluorescerande prober eller proteiner kompatibel med CLSM analys. Detta möjliggör online-visualisering och tillåter undersökning av nischer i utvecklingsländerna biofilmen. Mikrobiell inbördes, undersökning av antimikrobiella medel eller uttrycket av specifika gener, är av de många experimentella uppställningar som kan undersökas i flödescellen systemet.
Protocol
1. Montering av Flow Cell system med alla komponenter
Det samlade flödet systemet ingår: autoklaverbara slangar, fällor bubbla, medium / avfall flaska och celler flöde som visas i Figur 1. Alla dessa delar kan återanvändas mellan experiment.
Figur 1. Flödescell systeminställningsprogrammet (viktiga komponenter i installationen). Flödet cell består av flera komponenter: ett medium flaska, en peristaltiska pumpar, fällor bubbla, flödet cell, ett slöseri flaska, och olika delar av slang sammankopplade genom olika kontakter. Figur som vänligt av Rune Lyngklip.
2. Montering av Flow Cell
- Flödet cell (Figur 2a) behandlas med tunna körfält av silikon lim, med hjälp av en spruta (Figur 3).
- Placera en täckglas ovanpå silikon linjer (Figur 3). Glas täckglas används som substrat för P. aeruginosa medan PVC täckglas tillämpas för S. cerevisiae biofilm.
Figur 2. Schematisk bild av flödet cellen och bubbelfällan 2. Detaljerad beskrivning av de dimensioner som används för produktion av en) flödescell b) bubbelfälla, DTU systembiologi. Återges med tillstånd av John Wiley & Sons, Inc. (DTU systembiologi var tidigare rätt Biocentrum, som visas i figuren)
Figur 3. Illustration av ansökan silikon lim linjer för infästning av glas substrat. Den angivna skyddsglas placeras över silikon lim för att fästa den till flödet cellen.
- Vänd flödescell över och placera den på en plan yta med locket glida nedåt. Tryck försiktigt på baksidan av flödescellen att skjuta locket glida på basen av flödet cellen. Vänd flödescell över och inspektera för områden som inte förseglats av silikon. Handtaget (kolven) del av en spruta kan användas som ett verktyg för att försiktigt trycka på glaset och flödescell tillsammans.
3. Medium Flaska
- Placera en sondmatning silikon (2 mm innerdiameter) i en mellanstor flaska och sätt in en rak kontakt i den andra änden.
- Lägg medium till flaskan (för medelstora innehåll se "media" stycket)
Täck anslutning och flaska med metallfolie och autoklavera mediet. Se till att i slutet av utbudet röret är fast ovanför vätskenivån på medellång flaska eller en hävert effekten kan tom på medellång flaska när autoklavering.
4. Ansluta bubbelfällan Flow Cell och Pump
Montera alla slangar enligt riktlinjerna i figur 1. Använd silikonslang undantag för de delar som går igenom peristaltiska pumpar där Marprene slangar tillämpas.
- För att ansluta röret från mediet flaskan för att alla enskilda flöde kammare, dela en slang in erforderligt antal inkast tillämpas i experimentet. Använd T-kontakter för att göra det önskvärda antalet anslutning rör från fodret röret till Marprene rören i pumpen (se figur 1, T-kontakt). Det är generellt en bra idé att hålla samma sekvens ordning av rör och celler flödet i hela systemet, för att underlätta identifiering av komponenter vid fel i systemet.
- Anslut varje enskild inmatningsrör (2 mm i diameter) till Marprene rör i pumpen med raka kontakter. Anslut Marprene slangen till en bubbelfälla (figur 2b) via mellanliggande silikonslang (1 mm i diameter). Se till att pumpen är ansluten till inloppet på den högsta delen av bubbelfällan.
- Anslut den resulterande utloppsrör av bubblan fällor till flödescellen inloppet (1 mm i diameter), se till att längden på dessa slangar kan flödet cellen att flyttas till det stadium i konfokalmikroskop (vanligen 1 m).
- Häll 5 ml sprutor på toppen av bubblan fällor. Stäng toppar med passande lock.
- På flödescell uttaget ansluta en kort, cirka 40 mm bit (1 mm i diameter), slangar och använda en "minska" raka kontakten för att ansluta ett avfall röret (2 mm i diameter) som behövs längd. Placera avfallet rören i avfallsbehållare.
- Allt måste avfallsbehållaren alltid placeras på samma nivå som flödet celler, aldrig under flow-cellnivå. Se också till att slutet av avfallet slangen är fast över den förväntade nivån av avfall vätska för att undvika att spola tillbaka på grund av en hävert effekt vid hantering av flödet celler.
5. Sterilisera och Tvätta flödessystem
- Ta bort kapsyler bubbelfällan och placera dem i 70% etanol för att hålla dem sterila.
- Kör på högsta varvtal för att fylla systemet med 0,5% (v / v) natriumhypoklorit i vatten. </ Li>
- Placera caps bubbelfälla tillbaka på när bubblan fällorna är helt fylld.
- Tryck flödet cellerna att ta bort bubblor i flödet kammaren. Se till att inte skada den ömtåliga skyddsglas.
- Låt systemet att sterilisera för 3-4 h vid ett flöde på 3 ml / timme / kanal (0,2 mm / s linjärt flöde).
- Tvätta systemet 2-3 gånger för att tvätta bort alla hypoklorit. Fyll och töm systemet med sterilt vatten. Bubble fällor måste tömmas helt mellan varje tvätt. Detta kan göras genom att pumpa in luft tills bubblan fällor har tömts. Efter tömning, ta bort kapsyler ur bubblan fällor innan påfyllning av systemet. Sätt lock efter att bubblan fällor har helt fylld med vätska. Upprepa efter behov.
- Kör sterilt vatten genom systemet med ett lågt flöde (1-3 ml / tim / kanal) över natten eller gå vidare till nästa steg.
- Anslut mediet flaskan till inloppet och spola systemet med medel över natten på lågt flöde (3 ml / tim / kanal) vid den temperatur där försöket kommer att utföras. Obs: bubbla fällor måste tömmas på vatten innan systemet är fyllt med medium.
6. Inokulering av flödescell
- Från en övernattning kultur att göra en utspädning till en önskad optisk densitet (för P. aeruginosa t.ex. 0,001 OD 600 Nm och 0,1 OD 600 Nm för S. cerevisiae).
- Använd en 0,5 ml spruta med en 27G nål för att ladda tillräckligt inokulat för att fylla kammaren. 250 mikroliter räcker för flödet kamrarna med de mått som anges i detta arbete (Figur 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm).
- Stoppa peristaltiska pumpen.
- Kläm bort silikonslang som leder till flödet cellen för att förhindra tillbaka flöda in i systemet.
- Sterilisera inokulationsstället på silikonslang genom att torka av den med 70% etanol.
- För in nålen i silikon rör och för in spetsen i inloppet av flödet cellen. Spruta långsamt in inokulatet in i kammaren (var noga med att inte injicera luftbubblor).
- Ta bort nålen och torka av injektionsstället med 70% etanol följt av omedelbar tätning av hålet med silikon lim över injektionsstället.
- Vänd flödescellen och låt mikroorganismer följer underlaget för 1 timme utan att flödet genom flödescellen.
- Stäng av flödet cellen börjar mediet pumpen (3 ml / tim / kanal) och ta klämman från silikonslang.
- Systemet är placerat för inkubering vid 37 ° C i händelse av P. aeruginosa och 30 ° C vid S. cerevisiae.
- Biofilm i flödet kamrarna kan nu visualiseras genom CLSM.
7. Färgning av biofilm för mikroskopi
- Gör en utspädning av lämplig färgning (t.ex. 1:1000 Syto 9 lever fläcken för S. cerevisiae)
- Stoppa peristaltiska pumpen.
- Spänn av silikonslang som leder till flödet cellen.
- Sterilisera inokuleringsstället på silikonslang genom att torka av den med 70% etanol.
- Använd en 0,5 ml spruta med en 27G nål för att ladda tillräckligt färglösning för att fylla kammaren. 250 mikroliter räcker för flödet kamrarna används här.
- För in nålen i silikon rör och för in spetsen i inloppet av flödet cellen. Injicera långsamt färglösningen i kammaren (var noga med att inte injicera bubblor).
- Ta bort nålen och torka av injektionsstället med 70% etanol följt av omedelbar tätning av injektionsstället.
- Lämna flödescell utan flöde i 15 minuter.
- Ta bort klämman och starta flödet (3 ml / tim / kanal)
- Få uppgifter med CLSM
Discussion
Vi har visat ett flöde cell som utgör ett kraftfullt redskap i biofilmen utredningar. Kombinerat med 3D-avbildning av konfokalmikroskopi, har systemet en rad fördelar i jämförelse med andra metoder för att analysera mikrobiella biofilmer med hjälp av mer traditionella mikroskopiska tekniker. Detta system möjliggör 3D-visualisering av levande mikrobiell biofilm samhällen utan störningar i samhället. Ljusmikroskopi kommer inte att ge detaljerad information om nischer av biofilm och medan elektron mikroskopi ger nanoskala upplösning biofilm, tillåter den inte levande cell imaging.
Använda beskrivna systemet flödeskanal Vi har tidigare belyst den geografiska fördelningen av bakterieceller känslig för flera antibiotika 5-8 (figur 4a), distribution av extracellulära ämnen, t.ex. DNA 9-11 och distribution av rörliga och icke rörliga celler samma art inom en bakteriell gemenskap 4,6,9 (Figur 4c). Vi ser framför oss att flödet cellen systemet kan användas för att studera aspekter av jäst biofilmer. Detta kan vara rums tidsmässig fördelning av jäst biofilm som svar på miljöfaktorer såsom fungicider samt identifiering av gener involverade i jäst biofilmen utveckling. Även jäst inte är känd för att differentieras till rörliga och icke rörliga celler kan även andra aspekter på biofilm diversifiering vara studier såsom morfologiska övergången från jäst till pseudohyphal celler och skiftet från haploida till diploida celler.
Vi har visat ett system som uppfyller ett antal mikroorganismer och kommer att arbeta med flera färgningsteknik. En rad olika färgning sonder och fluorescerande proteiner, såsom GFP, aktivera specifik nisch undersökningar i utvecklingsländerna biofilm och är ett effektivt verktyg för att analysera effekten av antimikrobiella medel eller andra miljöfaktorer. Den information som kan vinnas är mycket detaljerad (Figur 4) och funktioner i biofilmen kan kvantifieras med datorprogram som COMSTAT 12,13.
Totalt sett är den mest kritiska aspekten av protokollet att det är en tidskrävande process. Det är också en begränsning att cellerna behöver för att kunna växa på ett icke-fluorescerande, öppen yta. . Eftersom biofilm bildas analyseras med hjälp av ett konfokalmikroskop, djupet som kan undersökas är begränsad till några hundra mikrometer 14 Det finns ytterligare tekniska begränsningar inneboende i design: systemet inte är lämpad för hög throughput screening, som en erfaren forskare kan hantera som mest cirka 15 kanaler per försök, vilket i sin tur kan ta flera dagar att förbereda sig. Däremot kan antibiotika eller mutanter som anses relevanta för biofilmen studier initialt massa undersökas med andra metoder såsom kristallviolett fläckar innan de mest intressanta kandidaterna överförs till flödescell systemet. Locket glasskivor är mycket tunna och går lätt sönder, och försiktighet bör iakttas vid hantering av systemen. Dessutom slangen bör undersökas dagligen under körningen av ett experiment, som betydande "back-tillväxt" i inloppet rör just uppströms i flödet celler kan förekomma. Sådana föroreningar kan lösas genom att ta bort flera centimeter av silikon röret från inloppssidan av flödet celler, med steril teknik.
Figur 4 a) 4 dag gammal PAO1 -. GFP biofilm behandlades för 24h med kolistin och propidiumjodid för döda färgning (röd färg) b) 3D-presentation av en tre dagar gammal s. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa vild typ) - GFP biofilm 6 c) 3D-bild presentation av en PAO1 - GFP pila mutant (blå) med en PAO1 vildtyp YFP (gul) d) 5 dagar gamla PAO1 - GFP biofilm presenteras som ett 3D- bild E) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutant i CEN.PK bakgrunden) biofilmen färgats med Syto-9 15.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Materials
Tubing:
Media
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Growing and analyzing biofilms in flow cells. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).
- Heydorn, A.
- Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).
- Haagensen, J. A. Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).
- Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).
- Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes. Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).
- Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy. Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).
- Barken, K. B. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).
- Qin, Z. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Allesen-Holm, M. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
- COMSTAT2, a semi-automated java-based quantification program for the analysis of microbial biofilms [Internet]. , Available from: http://www.comstat.dk/ (2010).
- Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Palmer, J. B. , Springer. 882-900 (2006).
- Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C. High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. Müller, S., Bley, T. , Springer. (2010).
