Summary
Protokoll beschreibt die Anwendung einer Messzelle für wachsende und Analyse von mikrobiellen Biofilmen für konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM).
Abstract
Viele mikrobielle Zellen haben die Fähigkeit, sessile mikrobielle Gemeinschaften wie Biofilmen, die physiologischen und pathologischen Eigenschaften verändert haben im Vergleich zu frei lebenden Mikroorganismen definierte Form. Biofilme in der Natur sind oft schwer zu untersuchen und unter schlecht definierten Bedingungen 1 befinden. Mit einem transparenten Substrat ist es möglich, Gerät ein System, wo einfache Biofilmen in eine nicht-destruktive Weise in Echtzeit untersucht werden kann: hier zeigen wir die Montage und den Betrieb einer Durchflusszelle Modellsystem für in vitro 3D-Untersuchungen der mikrobiellen Biofilmen Erzeugung hoher Reproduzierbarkeit unter genau definierten Bedingungen 2,3.
Das System besteht aus einer Flow-Zelle, die als Klimakammer für die Biofilm dient. Die Messzelle ist mit Nährstoffen und Sauerstoff aus einem Medium Kolben über eine peristaltische Pumpe zugeführt und verbrauchte Medium wird in einem Abfallbehälter gesammelt. Dieser Aufbau des Flow-System ermöglicht eine kontinuierliche Zufuhr von Nährstoffen und Verwaltung von zB Antibiotika mit minimaler Störung der Zellen in der Strömungskammer gewachsen. Darüber hinaus ermöglichen die Strömungsverhältnisse innerhalb der Durchflusszelle Studien von Biofilm ausgesetzt Schubspannung. Eine Blase Auffangeinrichtung Grenzen Luftblasen aus dem Schlauch, die sonst der Biofilm-Struktur in der Durchflusszelle stören könnten.
Die Durchflusszelle System ist kompatibel mit konfokale Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) und kann dadurch eine sehr detaillierte 3D-Informationen zur Entwicklung von mikrobiellen Biofilmen. Cells im Biofilm kann mit fluoreszierenden Sonden oder Proteine mit CLSM-Analyse bezeichnet werden. Dies ermöglicht Online-Visualisierung und ermöglicht Untersuchungen von Nischen in den Entwicklungsländern Biofilm. Mikrobielle Zusammenhang, Untersuchung von antimikrobiellen Wirkstoffen oder die Expression bestimmter Gene, sind die vielen Versuchsaufbauten, die in der Durchflusszelle System untersucht werden kann.
Protocol
1. Versammlung der Flow Cell System mit allen Komponenten
Die versammelten Flow-System umfasst: autoklavierbar Schläuche, Blasenfallen, medium / Abfallflasche und Messzellen, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle diese Teile können zwischen den Experimenten verwendet werden.
Abbildung 1. Die Durchflusszelle System-Setup (wesentliche Bestandteile des Setup). Die Messzelle besteht aus mehreren Komponenten: ein Medium-Flasche, eine Schlauchpumpe, Blasenfallen, die Messzelle, ein Abfallbehälter und diverse Teile der Schläuche mit verschiedenen Anschlüssen verbunden. Abbildung mit freundlicher Unterstützung von Rune Lyngklip zur Verfügung gestellt.
2. Versammlung der Durchflusszelle
- Die Messzelle (Abbildung 2a) ist mit dünnen Bahnen von Silikonkleber, mit einer Spritze (Abb. 3) behandelt.
- Legen Sie ein Deckglas auf dem Silikon-Linien (Abbildung 3). Glasdeckgläschen als Substrat für P verwendet aeruginosa, während PVC Deckgläser für S. angewandt werden cerevisiae Biofilm.
Abbildung 2. Schematische Darstellung der Durchflusszelle und Blasenfalle 2. Detaillierte Beschreibung der Dimensionen für die Herstellung von a) Flusszelle b) Blasenfalle, DTU Systems Biology verwendet. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung von John Wiley & Sons, Inc. (DTU Systems Biology war früher berechtigt Biocentrum, wie in der Abbildung dargestellt)
Abbildung 3. Illustration der Silikonkleber Anwendung Linien für die Befestigung des Glases Substrat. Die angegebenen Deckglas wird über den Silikon-Kleber platziert, um es auf die Messzelle anschließen.
- Schalten Sie die Durchflusszelle um und legen es auf eine ebene Fläche mit dem Deckglas nach unten. Drücken Sie vorsichtig auf die Rückseite der Messzelle auf das Deckglas auf der Basis der Flusszelle zu schieben. Schalten Sie die Messzelle über und untersuchen für Bereiche, die nicht durch das Silikon abgedichtet sind. Der Griff (Kolben) Teil einer Spritze kann als Werkzeug eingesetzt werden vorsichtig auf die Glas-und Flow-Zelle zusammen.
3. Medium Bottle
- Legen Sie eine Fütterung Silikonschlauch (2 mm Innendurchmesser) in einem Medium Flasche und legen Sie einen geraden Stecker am anderen Ende.
- Add Medium, um die Flasche (für mittel-Inhalt finden Sie unter "Medien" Absatz)
Cover-Anschluss und eine Flasche mit Metallfolie und Autoklaven des Mediums. Stellen Sie sicher, dass das Ende der Zuführrohr oberhalb des Flüssigkeitsspiegels in dem Medium Flasche oder ein Siphon-Effekt ist fest kann leer Medium Flasche beim Autoklavieren.
4. Anschließen der Blasenfalle, Durchflusszelle und Pump
Montieren Sie alle Schläuche nach der Gliederung in Abbildung 1. Verwenden Sie Silikonschlauch mit Ausnahme des Teils, der durch die Schlauchpumpe wo Marprene Schläuchen angewendet geht.
- Um das Rohr aus dem Medium Flasche auf alle einzelnen Strömungskammern verbinden, teilen einen Schlauch in die erforderliche Anzahl von Eingängen in das Experiment eingesetzt. Verwenden Sie T-Anschlüsse, um die gewünschte Anzahl der Verbindungsschläuche aus dem Einfüllstutzen zu machen, um die Marprene Rohre in der Pumpe (siehe Abbildung 1, T-Stecker). Es ist generell eine gute Idee, um die gleiche Sequenz, um von Rohren und Messzellen im gesamten System zu halten, um die Identifizierung von Komponenten im Falle von Fehlern im System zu erleichtern.
- Schließen Sie jedes einzelne Magensonde (2 mm im Durchmesser) zu Röhrchen in die Pumpe mit geraden Steckern Marprene. Schließen Sie das Marprene Schlauch an einer Blasenfalle (Abb. 2b) über die Zwischenstufe Silikonschlauch (1 mm im Durchmesser). Stellen Sie sicher, dass die Pumpe mit dem Eingang befindet sich am höchsten Teil der Blasenfalle verbunden.
- Schließen Sie die resultierende Auslaufrohr der Blasenfallen der Durchflusszelle Einlass (1 mm im Durchmesser), stellen Sie sicher, dass die Länge dieser Schläuche der Messzelle auf die Bühne des konfokalen Mikroskops (typischerweise 1 m) bewegt werden können.
- Platz 5 ml-Spritzen auf der Oberseite des Blasenfallen. Schließen Sie die Tops mit passenden Kappen.
- Auf der Messzelle Steckdose anschließen einer kurzen, ca. 40 mm Stück (1 mm im Durchmesser), Schläuche und die Nutzung einer "Reduzierung" straight-Anschluss zu einem Abfall Rohr befestigen (2 mm im Durchmesser) der benötigten Länge. Legen Abfall Rohre in den Abfallbehälter.
- Wichtig ist, dass die Abfallbehälter stets auf dem gleichen Niveau wie der Fluss-Zellen gelegt werden, nie unter flow-Zell-Ebene. Stellen Sie außerdem sicher, dass das Ende der Ablaufschlauch über dem erwarteten Niveau von Abfällen Flüssigkeit wird fest mit flush-back zu vermeiden durch einen Siphon-Effekt beim Umgang mit dem Flow-Zellen.
5. STERILISATION und Waschen des FLOW SYSTEM
- Entfernen Blasenfalle Kappen und legen Sie sie in 70% Ethanol sie steril zu halten.
- Run auf höchstem Pumpendrehzahl, um das System mit 0,5% (v / v) Natriumhypochlorit in Wasser zu füllen. </ Li>
- Legen Sie die Blasenfalle Kappen wieder auf, wenn die Blasenfallen vollständig ausgefüllt sind.
- Tippen Sie auf den Fluss Zellen zu Blasen in der Strömung Kammer zu entfernen. Achten Sie darauf, die fragile Deckglas Schäden.
- Lassen Sie das System für 3-4 h bei einer Flussrate von 3 ml / h / Kanal (0,2 mm / s linear flow rate) zu sterilisieren.
- Wash System 2-3 mal zu waschen alle Hypochlorit. Füllen und Entleeren der Anlage mit sterilem Wasser. Blasenfallen muss vollständig zwischen jedem Waschen entleert werden. Dies kann durch Einpumpen von Luft bis Blasenfallen geleert worden erfolgen. Nach der Entleerung zu entfernen Kappen von den Blasenfallen vor dem Nachfüllen des Systems. Ersetzen Kappen nach dem Blasenfallen wurden vollständig mit Flüssigkeit gefüllt. Wiederholen Sie je nach Bedarf.
- Run sterilem Wasser durch das System zu einem niedrigen Durchfluss (1-3 ml / h / Kanal) über Nacht oder gehen Sie zum nächsten Schritt.
- Schließen Sie das Medium Flasche mit dem Einlass und spülen Sie das System mit Medium über Nacht bei niedrigen Durchfluss (3 ml / h / Kanal) bei der Temperatur in dem das Experiment durchgeführt werden soll. Hinweis: Blasenfallen müssen für Wasser entleert werden, bevor das System mit Medium gefüllt ist.
6. Impfung des FLOW CELL
- Von einer Übernacht-Kultur eine Verdünnung auf eine gewünschte optische Dichte (für P. aeruginosa zB 0,001 OD 600nm und 0,1 OD 600nm für S. cerevisiae).
- Verwenden Sie eine 0,5 ml Spritze mit einer 27G Nadel, um genügend Inokulum laden, um die Kammer zu füllen. 250 ul ist ausreichend für die Strömungskammern mit den Abmessungen in dieser Arbeit angegeben (Abbildung 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm).
- Stoppen Sie die Schlauchpumpe.
- Clamp off der Silikonschlauch führt zu der Durchflusszelle zurück zu verhindern fließen in das System.
- Sterilisieren der Impfstelle auf dem Silikonschlauch durch Abwischen mit 70% Ethanol.
- Legen Sie die Nadel in den Silikonschlauch und stellen die Spitze in den Einlass der Durchflusszelle. Spritzen Sie das Inokulum in die Kammer (darauf achten, nicht, um Luftblasen zu injizieren).
- Entfernen Sie die Nadel und wischen Sie die Injektionsstelle mit 70% igem Ethanol durch sofortige Abdichtung der Bohrung mit Silikonkleber auf die Injektionsstelle gefolgt.
- Drehen Sie die Durchflusszelle und lassen Sie sich die Mikroorganismen an der Unterlage haften für 1 Stunde ohne Durchströmung der Durchflusszelle.
- Schalten Sie die Messzelle, starten Sie das Medium Pumpe (3 ml / h / Kanal) und nehmen Sie die Klemme aus dem Silikonschlauch.
- Das System ist für den Brutschrank bei 37 ° C im Fall von P. aeruginosa und 30 ° C im Fall von S. cerevisiae.
- Biofilm in den Fluss Kammern können nun visualisiert werden CLSM.
7. Färbung von BIOFILM Für die Mikroskopie
- Machen Sie eine Verdünnung der entsprechenden Färbung (z. B. 1:1000 Syto 9 live für S. cerevisiae-Färbung)
- Stoppen Sie die Schlauchpumpe.
- Clamp der Silikonschlauch führt zu der Durchflusszelle.
- Sterilisieren Impfstelle auf der Silikonschlauch durch Abwischen mit 70% Ethanol.
- Verwenden Sie eine 0,5 ml Spritze mit einer 27G Nadel, genug Färbelösung laden, um die Kammer zu füllen. 250 ul ist ausreichend für die Strömungskammern hier verwendeten.
- Legen Sie die Nadel in den Silikonschlauch und stellen die Spitze in den Einlass der Durchflusszelle. Langsam injizieren die Färbelösung in die Kammer (darauf achten, nicht zu Blasen spritzen).
- Entfernen Sie die Nadel und wischen Sie die Injektionsstelle mit 70% igem Ethanol durch sofortige Abdichtung der Injektionsstelle gefolgt.
- Verlassen Sie die Messzelle ohne Strömung für 15 Minuten.
- Nehmen Sie die Klemme und starten Sie den Strom (3 ml / h / Kanal)
- Erfassung von Daten mit dem CLSM
Discussion
Wir haben eine Durchflusszelle System, das ein mächtiges Werkzeug in Biofilm Untersuchungen stellt unter Beweis gestellt. In Kombination mit 3D-Bildgebung durch konfokale Mikroskopie, hat das System eine Reihe von Vorteilen im Vergleich zu anderen Methoden der Analyse von mikrobiellen Biofilmen mit Hilfe von traditionellen mikroskopischen Techniken. Dieses System ermöglicht 3D-Visualisierung von lebenden mikrobiellen Biofilm Gemeinden ohne Störung der Gemeinschaft. Die Lichtmikroskopie wird keine detaillierten Informationen über Nischen des Biofilms und während der Elektronenmikroskopie bietet nanoskaliger Auflösung des Biofilms, es nicht zulassen, Live Cell Imaging.
Mit dem beschriebenen Strömungskanal System, das wir zuvor die räumliche Verteilung der Bakterienzellen empfindlich auf verschiedene Antibiotika 5-8 (Abbildung 4a), die Verteilung der extrazellulären Verbindungen aufgeklärt, wie zB DNA 9-11 und die Verteilung der beweglichen und unbeweglichen Zellen der gleichen Art innerhalb einer bakteriellen Gemeinschaft 4,6,9 (Abbildung 4c). Wir sehen, dass die Messzelle System verwendet werden, um Aspekte der Hefe Biofilme zu untersuchen. Dies kann die räumlich zeitliche Verteilung der Hefe Biofilm als Reaktion auf Umweltfaktoren wie Fungizide sowie die Identifizierung von Genen in Hefe Biofilm Entwicklung einbezogen werden. Obwohl Hefe nicht bekannt ist, in bewegliche und unbewegliche Zellen differenzieren können auch andere Aspekte des Biofilms Diversifizierung Studien wie die morphologische Übergang von der Hefe bis zum pseudohyphal Zellen und die Verlagerung von haploid zu diploiden Zellen werden.
Wir haben ein System, das mit mehreren mikrobielle Spezies entsprechen und wird mit mehreren Färbetechniken Arbeit gezeigt. Eine Vielzahl unterschiedlicher Färbung Sonden und fluoreszierende Proteine, wie GFP, ermöglichen es, bestimmte Nische Untersuchungen in den Entwicklungsländern Biofilm und ist ein effizientes Werkzeug für die Analyse der Wirkung von Antibiotika oder anderen Umweltfaktoren. Die Informationen, die gesammelt werden können, ist sehr detailliert (Abbildung 4) und verfügt in den Biofilm kann mit Computerprogrammen wie COMSTAT 12,13 quantifiziert werden.
Insgesamt ist der wichtigste Aspekt des Protokolls der Tatsache, dass es ein zeitaufwändiger Prozess ist. Es ist auch eine Einschränkung, dass die Zellen müssen in der Lage, auf einem nicht-fluoreszierenden, transparenten Oberfläche wachsen. . Da der Biofilm gebildet wird analysiert mit einem konfokalen Mikroskop, die Tiefe, dass untersucht wird, um ein paar hundert Mikrometer 14 begrenzt werden kann, gibt es weitere technische Beschränkungen, die in das Design: Das System ist nicht für das Hochdurchsatz-Screening geeignet, da ein erfahrener Forscher können höchstens 15 Kanäle pro Experiment, das wiederum mehrere Tage dauern kann zur Vorbereitung zu behandeln. Allerdings können Antibiotika oder Mutanten, die als relevant für die Biofilm-Studien werden zunächst Masse mit anderen Methoden wie Kristallviolettfärbung abgeschirmt vor den interessantesten Kandidaten für die Flusszelle System übertragen werden. Der Deckel Glasscheiben sind sehr dünn und brechen leicht, und darauf zu achten, bei der Handhabung der Systeme. Neben den Schlauch sollte täglich während der Laufzeit eines Experiments untersucht werden, als erhebliche "back-Wachstum" in den Einlaßrohre kurz vor der Strömung Zellen auftreten können. Solche Verunreinigungen können durch das Entfernen von mehreren Zentimetern von Silikon-Schlauch von der Eingangsseite der Strömung Zellen gelöst werden, indem sterile Technik.
Abbildung 4 a) 4 Tage alte PAO1 -. GFP Biofilm für 24 Stunden mit Colistin und Propidiumiodid behandelt tot-Färbung (rot angefärbt) b) 3D-Darstellung eines 3 Tage alten P. aeruginosa PAO1 (P. aeruginosa Wildtyp) - GFP Biofilm 6 c) 3D-Bild-Darstellung eines PAO1 - CFP pila Mutante (blau) mit einem PAO1 Wildtyp YFP (gelb) d) 5 Tage alten PAO1 - GFP Biofilm als 3D vorgestellt Bild e) 26 h S. cerevisiae (ptr3 Mutanten in CEN.PK Hintergrund) Biofilm mit Syto-9 15 gefärbt.
Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Materials
Tubing:
Media
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