Pseudomonas aeruginosa ו biofilm Saccharomyces cerevisiae בתוך תאים Flow

Summary

הפרוטוקול מתאר את היישום של מערכת התא זרימה לגידול וניתוח biofilms חיידקים מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM).

Abstract

תאים של חיידקים רבים יש את היכולת ליצור קהילות מיקרוביאלי נייחים כהגדרתו biofilms כי שינו תכונות פיזיולוגיות פתולוגי לעומת מיקרואורגניזמים שחיים חינם. Biofilms בטבע הם לעתים קרובות קשה לחקור מתגוררים תחת תנאים מוגדרים היטב ^1. באמצעות תשתית שקוף זה אפשרי למכשיר מערכת שבה biofilms פשוטה ניתן לבדוק באופן בלתי הרסניות בזמן אמת: כאן אנו מדגימים את הרכבה והפעלה של מערכת התא זרימה מודל, עבור במבחנה 3D של biofilms חיידקים יצירת reproducibility גבוהה תחת תנאים מוגדרים היטב ^2,3.

המערכת כוללת תא זרימה המשמש חדר הצמיחה biofilm. התא זרימה מסופק עם חומרי מזון וחמצן מן הבקבוק בינוני באמצעות משאבה peristaltic ובינוניים בילה נאסף במיכל אשפה. זה בנייה של מערכת הזרימה מאפשר אספקה ​​רציפה של חומרים מזינים מתן אנטיביוטיקה למשל עם הפרעה מינימלית של תאים בוגרים בחדר זרימה. יתר על כן, תנאי הזרימה בתוך התא זרימה לאפשר מחקרים biofilm שנחשפו ללחץ גזירה. בועה השמנה גבולות מכשיר בועות אוויר מן הצינור, אשר אחרת עלולה לשבש את המבנה biofilm בתוך התא זרימה.

מערכת התא זרימה תואמת מיקרוסקופית סריקה Confocal לייזר (CLSM) והוא יכול ובכך לספק מידע 3D מפורט ביותר על פיתוח biofilms חיידקים. תאים biofilm יכול להיות מתויג עם בדיקות ניאון או חלבונים בקנה אחד עם ניתוח CLSM. זה מאפשר הדמיה מקוונת המאפשרת חקירת נישות biofilm המתפתח. הגומלין מיקרוביאלית, חקירת סוכני מיקרוביאלית או את הביטוי של גנים ספציפיים, הם של ניסויים רבים setups שניתן לחקור במערכת התא זרימה.

Protocol

1. האסיפה של מערכת תא זרימה עם כל הרכיבים

מערכת זרימה התאספו כוללת: צינורות autoclavable, מלכודות בועה, בינוני / בקבוק פסולת ותאי הזרימה כפי שמוצג באיור 1. כל החלקים הללו ניתן לעשות שימוש חוזר בין הניסויים.

באיור 1. התא זרימה מערכת ההתקנה (מרכיבים חיוניים של ההתקנה). מערכת התא זרימה מורכב מספר מרכיבים: בקבוק בינוני, משאבה peristaltic, מלכודות בועה, התא זרימה, בקבוק פסולת, וחתכים שונים של צינורות מחוברים על ידי מחברים שונים. איור מספקים בנדיבותם על ידי רונה Lyngklip.

2. האסיפה של התא זרימה

1. התא זרימה (איור 2 א) מטופל עם נתיבי דקה של דבק סיליקון, באמצעות מזרק (איור 3).
2. מניחים פיסת לכסות על גבי קווי סיליקון (איור 3). תלושי זכוכית לכסות משמשים תשתית עבור פ aeruginosa בעוד פתקי PVC לכסות מוחלים על S. cerevisiae biofilm.

איור 2. שרטוט סכמטי של התא זרימה מלכודת בועה ^2. תיאור מפורט של ממדים המשמש לייצור של מלכודת) תא ב) בועה זרימה, ביולוגיה DTU מערכות. והודפס מחדש באישור וג'ון וילי ובניו בע"מ (DTU Systems Biology היה זכאי בעבר Biocentrum, כמתואר באיור)

איור 3. איור של דבק סיליקון קווי הבקשה מצורף של תשתית הזכוכית. הזכוכית המכסה הצביעו מושם על הדבק סיליקון לצרף אותו התא זרימה.

3. הפעל את התא זרימה מעל ולמקם אותו על משטח שטוח עם הצד לכסות להחליק למטה. לחצו בעדינות על גבו של התא זרימה לדחוף את תלוש לכסות על בסיס של התא זרימה. הפעל את התא זרימה מעל ולבדוק עבור אזורים שאינם חתומים על ידי הסיליקון. (בוכנה) ידית חלק מזרק יכול לשמש ככלי בעדינות ללחוץ על תא הזכוכית וזרימת יחד.

3. בקבוק בינוני

1. הנח סיליקון צינור האכלה (2 מ"מ קוטר פנימי) בבקבוק בינוני להוסיף מחבר ישר בקצה השני.
2. הוסף בינוני עד הבקבוק (עבור תוכן בינוני לראות "התקשורת" פסקה)
   כיסוי מחבר בקבוק עם רדיד מתכת החיטוי הבינוני. ודא כי בסופו של צינור אספקה ​​קבועה מעל פני הנוזל בבקבוק בינוני או אפקט סיפון עשוי לרוקן את בקבוק בינוני כאשר מעוקר.

4. חיבור מלכודת הבועה, תזרים תא משאבה

להרכיב את כל צינורות על פי המתווה באיור 1. השתמש בצינור סיליקון למעט החלק שעובר המשאבה peristaltic שם צינורות Marprene מוחל.

1. כדי לחבר את הצינור מהבקבוק בינוני לכל חדרי תזרים בודדים, לפצל צינור למספר הנדרש של פתחי הכניסה מוחל בניסוי. השתמש ב-T-מחברים כדי להפוך את המספר הרצוי של צינורות חיבור בין צינור ההזנה של צינורות Marprene בתוך המשאבה (ראה איור 1, T-מחבר). זה בדרך כלל רעיון טוב כדי לשמור על הסדר אותו רצף של צינורות ותאי לזרום בכל המערכת, כדי להקל על זיהוי של רכיבים במקרה של תקלות במערכת.
2. חיבור כל צינור האכלה בודדים (2 מ"מ קוטר) כדי Marprene צינורות המשאבה באמצעות מחברים ישר. חבר את צינורות Marprene ללכוד בועה (איור 2b) דרך צינור סיליקון ביניים (1 מ"מ קוטר). ודא כי המשאבה מחוברת כניסת בחלק הגבוה של המלכודת בועה.
3. חבר את צינור מוצא וכתוצאה מכך של מלכודות בועה אל מפרצון את זרימת התא (1 מ"מ קוטר), לוודא כי אורך tubings אלה מאפשר התא זרימה להתרגש לשלב של המיקרוסקופ confocal (בדרך כלל 1 מ ').
4. מקום 5 מזרקים מ"ל על גבי מלכודות בועה. סגור את צמרות עם כמוסות מתאימות.
5. על מוצא התא זרימה חיבור קצר, כ 40 מ"מ של חתיכה (1 מ"מ קוטר), צינורות ולהשתמש "צמצום" מחבר ישר לצרף צינור פסולת (2 מ"מ קוטר) באורך הדרוש. המקום צינורות פסולת במיכל הפסולת.
6. חשוב לציין, מיכל פסולת חייב תמיד להיות ממוקם באותה רמה כמו תאים הזרימה, מעולם מתחת לרמה תזרים תאים. כמו כן, ודא כי בסופו של צינורות הפסולת הוא קבוע מעל פני הצפוי של פסולת נוזלית כדי למנוע סומק גב עקב אפקט הסיפון בעת ​​טיפול בתאי לזרום.

5. חיטוי ושטיפת מערכת זרימת

1. הסר מלכודת כמוסות בועה ולמקם אותם באתנול 70% כדי לשמור אותם סטריליים.
2. הפעלת המשאבה במהירות הגבוהה ביותר כדי למלא את המערכת עם 0.5% (V / V) hypochlorite נתרן במים. </ Li>
3. מניחים את מלכודת כמוסות בועה בחזרה כאשר מלכודות בועה מלאים לחלוטין.
4. לחץ על תאים זרימת כדי להסיר בועות בחדר זרימה. הקפד לא לפגוע זכוכית לכסות שביר.
5. אפשר מערכת לעקר עבור 3-4 שעות בקצב הזרימה של 3 מ"ל / שעה / ערוץ (0.2 מ"מ / s קצב זרימה ליניארי).
6. לשטוף את המערכת 2-3 פעמים כדי לשטוף את כל hypochlorite. מילוי לרוקן את המערכת עם מים סטריליים. מלכודות הבועה צריך להיות מרוקן לחלוטין בין כל לשטוף. ניתן לעשות זאת על ידי שאיבה באוויר עד מלכודות בועה כבר התרוקן. לאחר ריקון, להסיר כמוסות מן מלכודות בועה לפני מילוי המערכת. החלף כמוסות לאחר מלכודות בועה מולאו לחלוטין בנוזל. חזור כנדרש.
7. הפעל מים סטריליים באמצעות המערכת בקצב זרימה נמוכה (1-3 מ"ל / שעה / ערוץ) במשך לילה או להמשיך לשלב הבא.
8. חבר את בקבוק בינוני עד כניסת ולשטוף את המערכת עם בינוני במשך הלילה בקצב זרימה נמוכה (3 מ"ל / שעה / ערוץ) בטמפרטורה שבה הניסוי יבוצע. הערה: מלכודות בועה יש לרוקן את המים לפני מערכת מתמלא בינוני.

6. הרכבה של התא זרימה

1. מתוך התרבות לילה לעשות דילול צפיפות אופטית הרצוי (למשל עבור aeruginosa פ 0.001 OD _600nm ו - 0.1 OD _600nm עבור cerevisiae ס).
2. השתמש במזרק 0.5 מ"ל עם מחט 27G לטעון inoculum מספיק כדי למלא את החדר. 250 μL מספיק עבור לתאי תזרים בעל הממדים שצוינו בעבודה זו (איור 2., 40 מ"מ x 4 מ"מ x 1 מ"מ).
3. עצור את המשאבה peristaltic.
4. הצמד את צינורות סיליקון מובילים אל התא זרימה כדי למנוע חזרה לזרום לתוך המערכת.
5. לעקר את האתר חיסון על צינורות סיליקון ידי מנגב אותו עם אתנול 70%.
6. הכנס את המחט לתוך הצינור סיליקון להציג את קצה לתוך מפרצון של התא זרימה. לאט לאט להזריק את inoculum החדרה (להיזהר לא להזריק בועות אוויר).
7. הסר את המחט למחוק את האתר עם הזרקת אתנול 70% ואחריו אטימה מיידית של החור באמצעות דבק סיליקון על הזריקה.
8. הפוך את התא זרימה ולתת מיקרו אורגניזמים לדבוק לתשתית במשך שעה 1 ללא לזרום דרך התא זרימה.
9. הפעל את התא זרימה, להפעיל את המשאבה בינוני (3 מ"ל / שעה / ערוץ) ולקחת את מהדק את שפופרת סיליקון.
10. המערכת ממוקמת על הדגירה, בשעה 37 ° C במקרה של פ aeruginosa ו - 30 ° C במקרה של ס cerevisiae.
11. Biofilm בתאי תזרים כעת ניתן דמיינו ידי CLSM.

7. הכתמה של biofilm עבור מיקרוסקופיה

1. ביצוע דילול מכתים המתאים (למשל 1:1000 Syto 9 לחיות כתם על cerevisiae ס)
2. עצור את המשאבה peristaltic.
3. קלאמפ של צינורות סיליקון המוביל התא זרימה.
4. לעקר אתר חיסון על צינורות סיליקון ידי מנגב אותו עם אתנול 70%.
5. השתמש במזרק 0.5 מ"ל עם מחט 27G לטעון פתרון מכתים מספיק כדי למלא את החדר. 250 μL מספיק עבור לתאי תזרים משמש כאן.
6. הכנס את המחט לתוך הצינור סיליקון להציג את קצה לתוך מפרצון של התא זרימה. לאט לאט להזריק את הפתרון מכתים החדרה (להיזהר לא להזריק בועות).
7. הסר את המחט למחוק את האתר עם הזרקת אתנול 70% ואחריו איטום המיידית של הזריקה.
8. השאר את התא זרימה ללא זרימה במשך 15 דקות.
9. תוריד את מהדק ולהתחיל את הזרימה (3 מ"ל / שעה / ערוץ)
10. רוכשת את הנתונים עם CLSM

Discussion

אנחנו הוכיחו תא זרימה מערכת המייצגת כלי רב עוצמה בחקירות biofilm. בשילוב עם הדמיה 3D ידי מיקרוסקופיה confocal, המערכת מציעה מגוון יתרונות בהשוואה לשיטות אחרות של ניתוח biofilms חיידקים באמצעות שיטות מיקרוסקופיות מסורתיים יותר. מערכת זו מאפשרת הדמיית 3D של חיים מיקרוביאליים קהילות biofilm ללא הפרעה של הקהילה. במיקרוסקופ אור לא תספק מידע מפורט על נישות של biofilm ובעוד במיקרוסקופ אלקטרונים מספקת רזולוציה ננומטרי של biofilm, הוא אינו מאפשר הדמיה תא חי.

באמצעות ערוץ המתואר זרימת מערכת הובהר לנו בעבר את הפריסה המרחבית של תאים חיידקיים רגיש לאנטיביוטיקה מספר ^5-8 (איור 4 א), הפצה של חומרים תאיים, למשל DNA ו ^9-11, חלוקת תאים ניעתי ולא ניעתי של מאותו המין בתוך קהילה חיידקי ^4,6,9 (איור 4 ג'). אנו צופים כי המערכת התא זרימה ניתן ללמוד היבטים של biofilms שמרים. זה עשוי להיות הפצה spatio הזמני של biofilm שמרים בתגובה גורמים סביבתיים כמו קוטלי פטריות, וכן זיהוי של גנים המעורבים בהתפתחות biofilm שמרים. למרות שמרים לא ידוע להתמיין לתאי ניעתי ולא ניעתי, היבטים אחרים של גיוון עשוי להיות biofilm מחקרים כגון השינוי המורפולוגי של שמרים לתאי pseudohyphal ואת המעבר הפלואידים לתאי דיפלואידי.

הראינו מערכת לציית מינים של חיידקים כמה יעבוד עם טכניקות צביעה שונות. מגוון בדיקות מכתים שונים חלבוני ניאון, כגון ה-GFP, לאפשר חקירות נישה ספציפיים biofilm המתפתח והוא מהווה כלי יעיל בניתוח ההשפעה של סוכני מיקרוביאלית או גורמים סביבתיים אחרים. המידע ניתן להשיג מפורט מאוד (איור 4) ותכונות biofilm ניתן לכמת עם תוכנות מחשב כגון סטטמ"מ ^12,13.

בסך הכל, ההיבט הקריטי ביותר של פרוטוקול היא העובדה כי זהו תהליך גוזל זמן. זה גם מגבלה כי התאים צריכים להיות מסוגלים לגדול על משטח שאינו פלורסנט שקוף. . מכיוון biofilm נוצר מנותח באמצעות מיקרוסקופ confocal, עומק שניתן לחקור מוגבלת מאה מיקרומטר מספר ¹⁴ יש עוד מגבלות טכניות הטמון בעיצוב: המערכת אינו מתאים להקרנה תפוקה גבוהה, כחוקר מנוסה יכול לטפל בכ 15 ערוצי ביותר בכל ניסוי, אשר בתורו יכול לקחת כמה ימים כדי להתכונן. עם זאת, אנטיביוטיקה או מוטציות שנחשבים רלוונטיים ללימודי biofilm יכולים בתחילה להיות מסה הוקרן עם שיטות אחרות כגון מכתים סגול גביש לפני המועמדים המעניינים ביותר מועברים למערכת התא זרימה. יריעות כיסוי זכוכית דקים מאוד לשבור בקלות, יש להיזהר בעת הטיפול במערכות. בנוסף צינורות יש לבחון מדי יום במהלך הריצה של ניסוי, כמו רב "גב צמיחה" של צינורות כניסת רק נגד הזרם של תאים זרימת יכול להתרחש. זיהום מסוג זה ניתן לפתור על ידי הסרת כמה סנטימטרים של צינור סיליקון מהצד מפרצון של תאים הזרימה, באמצעות טכניקה סטרילית.

איור 4 PAO1 הישן) יום 4 -. Biofilm GFP שטופלו במשך 24 שעות עם Colistin ו יודיד Propidium עבור מכתים מת (כתם אדום) ב) מצגת 3D של יום שלוש פ 'הישן aeruginosa PAO1 (סוג P. aeruginosa בר) - GFP biofilm ⁶ ג) 3D מצגת תמונה של PAO1 - CFP Pila מוטציה (כחול) עם PAO1 סוג YFP בר (צהוב) ד) 5, יום PAO1 בן - GFP biofilm כפי שהוצגו 3D דואר תמונה) 26 ש 'ח (PTR3 מוטנטי CEN.PK רקע) biofilm cerevisiae מוכתם Syto-9 ^15.

Materials

Bubble traps, polyethylene (DTU Systems Biology, Technical University of Denmark, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument%20Center/Resources/Biofilm%20Setup.aspx ) Clear polypropylene plastic connectors and T-connectors (Cole Parmer, 1/8 in. (3.175 mm) and 1/16 in. (1.588 mm)) Clamps Confocal microscope (Zeiss, Meta LSM510) Coverslips, glass (Knittel Gläser) 50 x 24 mm Coverslips, PVC coverslips (Rinzl) 50 x 24 mm Flow cells, polyethylene (DTU Systems Biology, Technical University of Denmark, http://www.csm.bio.dtu.dk/Instrument%20Center/Resources/Biofilm%20Setup.aspx Medium bottles (Schott) Peristaltic Pump (Watson-Marlow, 205S) Rolling cart for flow systems and pumps Silicone glue (3M Super Silicone Sealant Clear) Syringe 5 mL (Terumo) Syto 9 (Molecular Probes) 0.5 mL Syringes with needles (27G, Terumo LU-100) Waste container Tubing: Silicone, 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter (Ole Dich) Silicone, 4 mm outer diameter, 2 mm inner diameter (Ole Dich) Marprene, 3 mm outer diameter, 1 mm inner diameter (Watson-Marlow) Media P. aeruginosa medium A10 g/L (NH4)2SO4 2.0 Na2HPO4 X 2H2O 6.0 KH2PO4 3.0 NaCl 3.0 Autoclave FB MgCl2 6H2O 0.20 1 mL 1 M CaCl2 0.01 100 μL/L Trace metals (for P. aeruginosa-biofilms)4 Autoclave Mix A10 and FB in a ratio of 1:10. Add carbon source to a desired concentration. S. cerevisiae synthetic complete (SC) medium g/L Adenine sulfate 0.02 L-tryptophan 0.02 L-histidine-HCL 0.02 L-arginine-HCL 0.04 L-methionine 0.02 L-tyrosine 0.05 L-leucine 0.06 L-isoleucine 0.06 L-lysine-HCL 0.05 L-phenylalanine 0.05 L-aspartic acid 0.10 L-glutamic acid 0.10 L-valine 0.15 L-threonine 0.20 L-serine 0.40 Yeast Nitrogen base w/o amino acids and ammonium (Bacto) 1.6 Ammonium sulphate 5.0 NaOH 6.0 Succinic acid 10.0 Autoclave Glucose (autoclaved separately) 0.20