Summary
Protocolo que describe la aplicación de un sistema de celda de flujo para el cultivo y el análisis de biofilms microbianos para microscopía de escaneo láser confocal (CLSM).
Abstract
Muchas células microbianas tienen la capacidad de formar comunidades de microorganismos sésiles define como biofilms que han alterado las propiedades fisiológicas y patológicas en comparación con los microorganismos de vida libre. Biofilms en la naturaleza son a menudo difíciles de investigar y residen en condiciones de poca definida 1. El uso de un sustrato transparente, es posible que un sistema en el dispositivo de biofilms simple puede ser examinado en una forma no destructiva en tiempo real: aquí se demuestra el montaje y operación de un sistema de flujo modelo de celular, para los estudios in vitro en 3D de biopelículas microbianas generando una alta reproducibilidad bajo condiciones bien definidas 2,3.
El sistema consta de una celda de flujo que sirve como cámara de crecimiento de la biopelícula. La celda de flujo se suministra con nutrientes y oxígeno a partir de un frasco de medio a través de una bomba peristáltica y medio gastado se recoge en un recipiente de residuos. Esta construcción del sistema de flujo permite un suministro continuo de nutrientes y la administración de antibióticos por ejemplo, con la mínima perturbación de las células cultivadas en la cámara de flujo. Por otra parte, las condiciones de flujo dentro de la celda de flujo permiten estudios de biofilm expuestos a esfuerzos cortantes. Una burbuja de captura confines dispositivo de burbujas de aire de la tubería que podrían alterar la estructura del biofilm en la celda de flujo.
El sistema de celda de flujo es compatible con microscopía de escaneo láser confocal (CLSM) y por lo tanto puede proporcionar información en 3D muy detallado sobre el desarrollo de biopelículas microbianas. Las células en el biofilm pueden ser etiquetados con sondas fluorescentes o proteínas compatible con el análisis de CLSM. Esto permite la visualización en línea y permite la investigación de nichos en el biofilm en desarrollo. Interrelación microbiana, la investigación de agentes antimicrobianos o la expresión de genes específicos, son muchas de las configuraciones experimentales que se pueden investigar en el sistema de celda de flujo.
Protocol
1. Montaje del sistema de celda de flujo con todos los componentes
El sistema de flujo montado incluye: tubos de autoclave, trampas de burbujas, una botella de medio / residuos y células de flujo como se muestra en la Figura 1. Todas estas piezas se pueden reutilizar entre los experimentos.
Figura 1. La celda de flujo de configuración del sistema (componentes esenciales de la configuración). El sistema de celda de flujo consta de varios componentes: una botella de medio, una bomba peristáltica, trampas de burbujas, la celda de flujo, una botella de residuos, y diversas secciones de la tubería entre sí por conectores diferentes. Figura amablemente proporcionados por Runa Lyngklip.
2. Asamblea de la celda de flujo
- La celda de flujo (Figura 2a) se trata con carriles fina de pegamento de silicona, con una jeringa (Figura 3).
- Coloque una hoja de cubierta en la parte superior de las líneas de silicona (Figura 3). Se desliza cubierta de vidrio se utilizan como sustrato para P. aeruginosa, mientras se desliza la cubierta de PVC se aplican para S. cerevisiae biofilm.
Figura 2. Esquema de la celda de flujo y la trampa de la burbuja 2. Descripción detallada de las dimensiones utilizadas para la producción de una trampa de la burbuja) flujo de células b), DTU Biología de Sistemas. Reproducido con permiso de John Wiley & Sons, Inc., (DTU Biología de Sistemas tenía anteriormente derecho Biocentrum, como se muestra en la figura)
Figura 3. Ilustración de las líneas de aplicación de silicona pegamento para la fijación del sustrato de vidrio. La cubierta de vidrio se indica se coloca sobre el pegamento de silicona para sujetarlo a la celda de flujo.
- A su vez la celda de flujo y colóquelo sobre una superficie plana con la cara cubierta antideslizante abajo. Presione suavemente en la parte posterior de la celda de flujo para empujar la hoja de la cubierta en la base de la celda de flujo. A su vez la celda de flujo e inspecciona las áreas que no están sellados por la silicona. El mango (pistón) de una jeringa se puede utilizar como una herramienta para presionar suavemente la celda de vidrio y confluyen.
3. Botella medio
- Colocar un tubo de silicona de alimentación (2 mm de diámetro interior) en una botella de medio e insertar un conector en línea recta en el otro extremo.
- Se añade medio de la botella (para ver el contenido medio de "los medios de comunicación" del párrafo)
Cubierta del conector y una botella con papel de aluminio y autoclave el medio. Asegúrese de que el extremo del tubo de suministro se fija por encima del nivel de líquido en la botella de medio o un efecto de sifón puede vaciar la botella medio al autoclave.
4. Conexión de la trampa de la burbuja, celda de flujo y bomba
Montar toda la tubería de acuerdo con el esquema de la Figura 1. Use un tubo de silicona con excepción de la parte que va a través de la bomba peristáltica donde se aplica tubo Marprene.
- Con el fin de conectar el tubo de la botella medio a todas las cámaras de flujo individual, dividir un tubo en el número necesario de entradas aplicadas en el experimento. Use los conectores en T para que el número deseable de los tubos de conexión del tubo de alimentación a los tubos de Marprene en la bomba (ver Figura 1, T-conector). Es generalmente una buena idea para mantener el orden en la misma secuencia de los tubos y las celdas de flujo a través del sistema, para facilitar la identificación de los componentes en caso de fallas en el sistema.
- Conecte cada tubo de alimentación individual (2 mm de diámetro) para Marprene tubos de la bomba con conectores rectos. Conecte el tubo de Marprene a una trampa de burbujas (figura 2b) a través de un tubo de silicona intermedio (1 mm de diámetro). Asegúrese de que la bomba está conectada a la entrada en la parte más alta de la trampa de la burbuja.
- Conecte el tubo de salida resultante de las trampas de burbujas a la entrada de la celda de flujo (1 mm de diámetro), asegúrese de que la longitud de estos tubos permite a la célula de flujo que se mueve a la platina del microscopio confocal (normalmente 1 m).
- Coloque jeringas de 5 ml en la parte superior de la trampa de la burbuja. Cierre las tapas con tapones adecuados.
- En la salida de la celda de flujo conectar un corto, de aproximadamente 40 mm de piezas (1 mm de diámetro), la tubería y el uso de una "reducción" recto para conectar un tubo de drenaje (2 mm de diámetro) de la longitud necesaria. Coloque los tubos de desecho en el contenedor de residuos.
- Es importante destacar que el contenedor de residuos se deben colocar siempre en el mismo nivel que las células de flujo, nunca por debajo del nivel de flujo de células. Además, asegúrese de que el final del tubo de drenaje se fija por encima del nivel esperado de desechos líquidos para evitar ras de espalda debido a un efecto de sifón cuando el manejo del flujo de las células.
5. ESTERILIZACIÓN Y LAVADO DEL SISTEMA DE FLUJO
- Quite las tapas de la burbuja trampas y colocarlas en el 70% de etanol para mantenerlos estériles.
- Correr a mayor velocidad de la bomba para llenar el sistema con un 0,5% (v / v) de hipoclorito de sodio en el agua. </ Li>
- Colocar las tapas de la trampa de burbujas de nuevo cuando la burbuja de las trampas están completamente llenos.
- Toque en el flujo de las células para eliminar las burbujas en la cámara de flujo. Tenga cuidado de no dañar la cubierta de vidrio frágil.
- Deje que el sistema de esterilización de 3-4 h con un caudal de 3 ml / h / canal (tasa de 0,2 mm / s de flujo lineal).
- Lave el sistema de 2.3 veces para vaciar todo el hipoclorito. Llenar y vaciar el sistema con agua estéril. Trampas de burbujas se debe vaciar por completo entre cada lavado. Esto se puede hacer mediante el bombeo en el aire hasta que las trampas de la burbuja han sido vaciados. Después de vaciar, quitar las tapas de las trampas de burbujas antes de rellenar el sistema. Vuelva a colocar las tapas después de la burbuja de las trampas han sido completamente llena de líquido. Repita según sea necesario.
- Deje correr el agua estéril a través del sistema, con un caudal bajo (1-3 ml / h / canal) durante la noche o ir al siguiente paso.
- Conecte la botella medio de la entrada y limpie el sistema con el medio de toda la noche a bajo caudal (3 ml / h / canal) a la temperatura donde se realizará el experimento llevado a cabo. Nota: trampas de burbujas se debe vaciar el agua antes de que el sistema se llena con el medio.
6. La inoculación de la celda de flujo
- De una cultura de la noche hacer una dilución a una densidad óptica deseada (por ejemplo, P. aeruginosa 0.001 OD 600 nm y 600 nm de diámetro exterior 0,1 S. cerevisiae).
- Use una jeringa de 0,5 ml con una aguja 27G para cargar inóculo suficiente para llenar la cámara. 250 l es suficiente para que las cámaras de flujo con las dimensiones especificadas en este trabajo (Figura 2., 40 mm x 4 mm x 1 mm).
- Detener la bomba peristáltica.
- Abrazadera de la manguera de silicona que lleva a la celda de flujo para evitar el reflujo en el sistema.
- Esterilizar el sitio de la inoculación en el tubo de silicona frotándolos con etanol al 70%.
- Insertar la aguja en el tubo de silicona e introducir la punta en la entrada de la celda de flujo. Inyecte lentamente el inóculo en la cámara (con cuidado de no inyectar burbujas de aire).
- Retire la aguja y limpie la zona de inyección con etanol al 70%, seguido de cerrado de inmediato el agujero con pegamento de silicona sobre el sitio de inyección.
- Dé la vuelta a la celda de flujo y dejar que los microorganismos se adhieren al sustrato durante 1 hora sin flujo a través de la celda de flujo.
- A su vez la celda de flujo, en marcha la bomba de mediano (3 ml / h / canal) y tomar la abrazadera del tubo de silicona.
- El sistema se coloca para la incubación a 37 ° C en el caso de P. aeruginosa y 30 ° C en el caso de S. cerevisiae.
- Biopelícula en las cámaras de flujo ahora puede ser visualizado por CLSM.
7. La tinción de BIOFILM de Microscopía
- Hacer una dilución de la coloración adecuada (por ejemplo, 1:1000 SYTO 9 viven mancha de S. cerevisiae)
- Detener la bomba peristáltica.
- Abrazadera del tubo de silicona que lleva a la celda de flujo.
- Esterilizar sitio de la inoculación en el tubo de silicona frotándolos con etanol al 70%.
- Use una jeringa de 0,5 ml con una aguja 27G para cargar la solución de tinción suficiente para llenar la cámara. 250 l es suficiente para que las cámaras de flujo se utilizan aquí.
- Insertar la aguja en el tubo de silicona e introducir la punta en la entrada de la celda de flujo. Inyecte lentamente la solución de tinción en la cámara (tenga cuidado de no inyectar burbujas).
- Retire la aguja y limpie la zona de inyección con etanol al 70%, seguido de cerrado de inmediato el lugar de inyección.
- Salir de la celda de flujo sin flujo durante 15 minutos.
- Retire la abrazadera e iniciar el flujo (3 ml / h / canal)
- Adquisición de datos con el CLSM
Discussion
Hemos demostrado un sistema de celda de flujo que representa una poderosa herramienta en las investigaciones de biofilm. Combinado con imágenes en 3D mediante microscopía confocal, el sistema tiene una serie de ventajas en comparación con otros métodos de análisis de biopelículas microbianas mediante técnicas microscópicas más tradicionales. Este sistema permite la visualización en 3D de las comunidades microbianas que viven biofilm sin alteración de la comunidad. Microscopía de luz no se proporcione información detallada sobre los nichos de la biopelícula y al mismo tiempo proporciona una resolución de la microscopía electrónica a nanoescala de la biopelícula, que no permite imágenes de células vivas.
Utilizando el sistema de flujo de canal descrito anteriormente hemos dilucidado la distribución espacial de las células bacterianas sensibles a varios antibióticos 5-8 (Figura 4a), la distribución de los compuestos extracelulares, por ejemplo, ADN y 11.9, la distribución de células móviles y no móviles de la misma especie dentro de una comunidad bacteriana 4,6,9 (Figura 4c). Tenemos la visión de que el sistema de celda de flujo se pueden utilizar para estudiar los aspectos de las biopelículas de levadura. Esta puede ser la distribución espacio temporal de biofilm de la levadura en respuesta a factores ambientales, tales como fungicidas, así como la identificación de genes implicados en el desarrollo de la levadura biofilm. A pesar de la levadura no se sabe a diferenciarse en células móviles y no móviles, otros aspectos de la diversificación de biofilm pueden ser los estudios tales como el cambio morfológico de la levadura a las células pseudohyphal y el cambio de haploides a las células diploides.
Hemos mostrado un sistema que cumple con varias especies de microbios, y trabajará con varias técnicas de tinción. Una gran variedad de sondas de coloración diferente y las proteínas fluorescentes, tales como las buenas prácticas agrarias, facilitar la investigación específica de nicho en el biofilm en desarrollo y es una herramienta eficaz para analizar el efecto de los agentes antimicrobianos u otros factores ambientales. La información que se puede obtener es muy detallado (Figura 4) y las características del biofilm pueden ser cuantificados con los programas de ordenador como COMSTAT 12,13.
En general, el aspecto más importante del protocolo es el hecho de que se trata de un proceso que consume tiempo. También es una limitación que las células deben ser capaces de crecer en un no-fluorescente, la superficie transparente. . Dado que la formación de biopelículas se analiza con un microscopio confocal, la profundidad que puede ser investigado se limita a unos pocos cientos de micrómetros 14 Hay más limitaciones técnicas inherentes en el diseño: el sistema no es adecuado para el cribado de alto rendimiento, como un investigador experimentado puede manejar más de 15 canales por experimento, que a su vez puede tomar varios días para prepararse. Sin embargo, los antibióticos o los mutantes que se consideran relevantes para los estudios de bio-película puede ser inicialmente masa tamizada con otros métodos como la tinción de cristal violeta antes de que los candidatos más interesantes son transferidos al sistema de celda de flujo. Las hojas de cristal de la cubierta son muy finas y se rompen con facilidad, y se debe tener cuidado al manipular los sistemas. Además los tubos deben ser examinados todos los días durante la ejecución de un experimento, como considerable "back-crecimiento" en los tubos de entrada justo antes de la células de flujo puede ocurrir. Tal contaminación puede ser resuelto mediante la eliminación de varios centímetros de tubo de silicona del lado de la entrada de las células de flujo, utilizando una técnica estéril.
Figura 4 a) cuatro días PAO1 de edad -. Biofilm las buenas prácticas agrarias tratadas durante 24 horas con colistina y yoduro de propidio para la tinción de muertos (mancha roja) b) presentación en 3D de un día de tres años de edad P. aeruginosa PAO1 (tipo salvaje P. aeruginosa) - GFP biofilm 6 c) presentación de imágenes 3D de una PAO1 - PPC pila mutante (azul) con un tipo de YFP PAO1 silvestres (amarillo) d) 5 días de edad PAO1 - GFP biofilm presenta como un 3D e imagen) 26 h S. cerevisiae (PTR3 mutante en CEN.PK fondo) biofilm teñidas con SYTO-9 15.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Materials
Tubing:
Media
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References
- Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections. Science. 284, 1318-1322 (1999).
- Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Growing and analyzing biofilms in flow cells. Curr Protoc Microbiol. Chapter 1, 2-2 (2006).
- Heydorn, A. Experimental reproducibility in flow-chamber biofilms. Microbiology. 146, 2409-2415 (2000).
- Pamp, S. J., Tolker-Nielsen, T. Multiple roles of biosurfactants in structural biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 189, 2531-2539 (2007).
- Haagensen, J. A. Differentiation and distribution of colistin- and sodium dodecyl sulfate-tolerant cells in Pseudomonas aeruginosa biofilms. J Bacteriol. 189, 28-37 (2007).
- Klausen, M., Aaes-Jorgensen, A., Molin, S., Tolker-Nielsen, T. Involvement of bacterial migration in the development of complex multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Mol Microbiol. 50, 61-68 (2003).
- Pamp, S. J., Gjermansen, M., Johansen, H. K., Tolker-Nielsen, T. Tolerance to the antimicrobial peptide colistin in Pseudomonas aeruginosa biofilms is linked to metabolically active cells, and depends on the pmr and mexAB-oprM genes. Mol Microbiol. 68, 223-240 (2008).
- Pamp, S. J., Sternberg, C., Tolker-Nielsen, T. Insight into the microbial multicellular lifestyle via flow-cell technology and confocal microscopy. Cytometry Part A. 75A, 90-103 (2009).
- Barken, K. B. Roles of type IV pili, flagellum-mediated motility and extracellular DNA in the formation of mature multicellular structures in Pseudomonas aeruginosa biofilms. Environ Microbiol. 10, 2331-2343 (2008).
- Qin, Z. Role of autolysin-mediated DNA release in biofilm formation of Staphylococcus epidermidis. Microbiology. 153, 2083-2092 (2007).
- Allesen-Holm, M. A characterization of DNA release in Pseudomonas aeruginosa cultures and biofilms. Mol Microbiol. 59, 1114-1128 (2006).
- Heydorn, A. Quantification of biofilm structures by the novel computer program COMSTAT. Microbiology. 146, 2395-2407 (2000).
- COMSTAT2, a semi-automated java-based quantification program for the analysis of microbial biofilms [Internet]. , Available from: http://www.comstat.dk/ (2010).
- Palmer, R. J., Haagensen, J. A., Neu, T. R., Sternberg, C. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Palmer, J. B. , Springer. 882-900 (2006).
- Haagensen, J. A., Regenberg, B., Sternberg, C. High Resolution Microbial Single Cell Analytics Advances in Biochemical Engineering and Biotechnology. Müller, S., Bley, T. , Springer. (2010).
