Summary
Här beskriver vi en analys som sysselsätter kraften i mikroinjektion kombination med fluorescerande
Abstract
I eukaryoter är budbärar-RNA (mRNA) transkriberas i cellkärnan och måste exporteras till cytoplasman att få tillgång till översättningen maskiner. Även om kärnkraft export av mRNA har studerats ingående i Xenopus äggceller 1 och genetiskt tractable organismer som jäst 2 och Drosophila härstammar S2 cellinje 3, hade få studier genomförts i däggdjursceller. Dessutom kinetiken av mRNA exporteras i däggdjursceller somatiska celler endast kunde härledas indirekt 4,5. För att mäta den nukleära exporten kinetiken av mRNA i däggdjursceller vävnadsodling, har vi utvecklat en analysmetod som använder kraften i mikroinjektion kombination med fluorescent in situ hybridisering (FISH). Dessa analyser har använts för att påvisa att i däggdjursceller, är majoriteten av mRNA exporteras i en skarvning sätt vid 6,7, eller på sätt som kräver särskilda RNA-sekvenser som signalsekvensen kodande region (SSCR) 6. I denna analys är celler idag injiceras med antingen in vitro syntetiseras mRNA eller plasmid-DNA som innehåller genen av intresse. Den idag injiceras cellerna inkuberas för olika tidpunkter då fast och sub-cellulära lokalisering av RNA bedöms med hjälp av FISH. I motsats till transfektion, där transkriptionen förekommer flera timmar efter tillsats av nukleinsyror, gör mikroinjektion av DNA eller mRNA för snabb uttryck och möjliggör generering av exakta kinetiska data.
Protocol
Det finns två mikroinjektion-baserade metoder som kan användas för att mäta kinetiken av mRNA exporteras i däggdjursceller, injektion av in vitro-syntetiserade mRNA eller plasmid-DNA, som kopieras in vivo till mRNA. Varje teknik har sina fördelar och nackdelar. Här beskriver vi båda teknikerna och diskutera skillnaderna mellan de två metoderna.
1. Förberedelse av material för injektion
- In vitro transkriberade mRNA
- mRNA transkriberas från antingen plasmider eller PCR-produkter som innehåller genen av intresse flankeras uppströms med lämplig RNA-polymeras promotor (dvs. T7 eller SP6 projektansvariga). Transkription sker in vitro med hjälp av lämpliga enzym (T7 eller SP6 RNA-polymeras, Invitrogen) med lämpliga nukleotider och överskott mössa analog.
- Avskrifter är polyadenylated in vitro med hjälp av Poly-A-polymeras (Invitrogen) och ATP enligt tillverkarens protokoll.
- MRNA renas sedan med hjälp av kolumner från antingen Invitrogen eller Qiagen.
- Elueras mRNA sedan fälls ut genom att lägga till 1/20th volym 3M kaliumacetat och 2 volymer på 100% etanol vid -20 ° C i en timme följt av centrifugering vid 13.000 g vid 4 ° C i 30min. Om överflödig vätska är närvarande, kan pelleten tvättas med iskall 70% etanol.
- Den resulterande mRNA pellet luften torkas sedan solubilised i injektionsteknik buffert (140mm KCl och 10 mM HEPES, pH 7,4). Observera att sådana föroreningar som etanol kan vara giftiga för idag injiceras cellen. Den solubilized mRNA kan förvaras vid -80 ° C för långtidsförvaring.
- För mikroinjektion är mRNA späds ut till 200μg/ml i injektionsteknik buffert och blandas med Oregon Grön 488 (OG)-konjugerade 70kDa dextran (1mg/ml, Invitrogen). Eftersom OG-konjugerade dextran är för stor för att sprida över nukleära porer kommer det möjligt för en inte bara att identifiera injicerade cellerna, men också hjälpa till att avgöra hur mycket av den vätska sprutas in i cellkärnan och hur mycket läckte in i cytoplasman ( se 4.1.2). Alternativt kan alla lysrör, hög molekylvikt molekyl som inte kan korsa nukleära porer användas.
- Prover centrifugeras vid 13 tusen g vid 4 ° C under minst 20 minuter före lastningen nålen för att pellets eventuella partiklar som eventuellt kan hindra nålspetsen.
- Plasmid-DNA
- Plasmid-DNA som innehåller genen av intresse kan framställas med hjälp av vanliga kit DNA-rening från Qiagen. Allmänhet större DNA förberedelser tenderar att vara av högre kvalitet och därmed är mer effektivt transkriberas efter injektionen.
- Plasmid-DNA späds 50 till 200μg/ml i injektionsteknik buffert innehållande OG-konjugerade 70 kDa dextran (1mg/ml).
- Före lastning nålen är injektionsvätska centrifugeras vid 13 tusen g vid 4 ° C i minst 20min.
- Nålar för mikroinjektion
- Nålar är tillverkat av 1,0 mm borsilikatglas kapillärrör (Produkt # 1B100F-3, World precisionsinstrument Inc.) med ett Sutter P97 Flaming / Brun Mikropipett avdragare med en 2.5mm glödtråd.
- Den injektionsnålar genereras med hjälp av en tre steg drar program med en 2.5x4.5 glödtråd mm rutan (punkt # FB245B, Sutter Instrument Co). Programmet parametrar som används i detta experiment är listade nedan, men de bör optimeras för varje glödtråd.
Steg # Hetta Dra Velocity Tid Tryck 1 740 100 8 250 500 2 740 100 8 250 500 3 740 100 10 250 500
(Ramp temperatur = 740)
- Cellberedningen
- Generellt någon cellinje från däggdjur kan idag injiceras dock celltyper som är väl spridda tenderar att vara mer mottaglig för injektion. Valet av cellinje kan även bero på andra faktorer. Till exempel mRNA som kodar för utsöndrade proteiner är riktade till ytan i endoplasmatiska retiklet och detta är mycket mer synliga i COS-7 celler jämfört med NIH 3T3 fibroblaster 6 (jämför lokalisering av t-FTZ-Δi mRNA i siffror 3 och 4).
- Celler bör vara seedade på syratvättad torget täckglas (25x25mm) i 30mm petridishes i minst 24 timmar innan mikroinjektion. I vissa cellinjer kan sprida stimuleras genom bordläggning celler på fibronektin belagda täckglas 6,8. Helst den cellulära cellslager bör vara ungefär 70-90% confluent vid tiden för injektion.
- För att möjliggöra enkel identifiering av injicerade celler, är cellen cellslager sårade före injektion med hjälp av en 200μl spets plastpipetten. Generellt ett kors sår (figur 1) är etsad på täckglas och cellerna är kvar att återhämta sig i minst 15 min före injektion i vävnadsodling inkubatorn.
- Under mikroinjektion, förlorar vävnadskultur medier långsamt CO 2 av diffusion och som ett resultat blir alkali. För att upprätthålla ett neutralt pH under injektion, kan media kompletteras med 10mm HEPES pH 7,4. Den extra buffert kan läggas till medierna dagen innan mikroinjektion.
- Mikroskop och mikromanipulator
- Celler är idag injiceras med ett inverterat mikroskop som är isolerad på en luft-tabellen för att minimera vibrationer som kan vara störande för mikroinjektion processen. Mikroskopet är utrustat med två mål, ett torrt 10x pjäs, som används för att positionera celler och nålen, och en torr 40x extra långa arbetsavstånd fas mål, som används för att bilden mikroinjektion processen.
- Optiska avvikelser orsakas genom att visa celler inom hela täckglas och petridish kan elimineras om målet är en korrigering krage. Säkerställa att mikroskop är brightfield är korrekt inställd för Köhler belysning 9, kommer också att hjälpa korrigera för avvikelser som orsakas av att ljus sprids av injektionsnål (se 2.2.4).
- Nålen styrs av en treaxlig hängande joystick mikromanipulation enhet (NT-88-V3MSH, Narishige). De grova manipulatorn är fastsatt i ryggen pelaren i mikroskop för att låta nålen lätt kan höjas och sänkas i skålen och samtidigt behålla sin ursprungliga position.
- Nålen är fastsatt på en stav som är fastspänd till grov manipulator. Ett rör ansluter staven till en 5cc glasspruta (Produkt # 512.311, Becton Dickinson), som genererar insprutningstryck krävs för att mata ut vätska från spetsen av mikroinjektion nålen. För reglering av trycket nivå är sprutan och kolven hålls på plats av en spruta regulator som består av två proppar, en rörklammer (finns vid varje järnaffär) och två klämmor av metall (Figur 2). För att säkerställa att sprutan håller högt tryck, vakuum fett (Dow Corning) tillämpas på sprutkolven.
- Den fluorescerande Hybridisering Probe
- Den primära sekvens av den injicerade nukleinsyra är vikt med hjälp av RNA sekundära programvarans struktur förutsägelse, som RNAstructure 4,6 10.
- MRNA veck är visuellt bedömt att identifiera ett område på ca 50 nukleotider som brukar vara fri från sekundära strukturer med höga smälttemperaturer, såsom långa dubbla trådar.
- Det omvända komplement till denna region är syntetiseras med en Alexa546 fluoroforen bifogas 5 "sondens ände (Dessa kan köpas från Integrated DNA-teknik).
- Sonden späds med vatten till en koncentration av 100μM och lagras vid -80 ° C i 2-3 år.
2. Intranuclear mikroinjektion
- Fylla på injektionsvätska på mikroinjektion mikroskop
- Cirka 1μl av injektionsvätska dras från centrifugeras DNA eller mRNA provet med hjälpGELoader tips (Produkt # 022.351.656, Epindorff). Flytande bör aspireras från toppen av provet för att undvika att störa pelleten som innehåller partiklar som kan täppa igen kanylen.
- Spetsen på pipetten sätts in i den bakre änden av nålen och vätskan matas ut. Flytande kommer att dras till nålspetsen med kapillärkraft och en menisk nära spetsen ska vara synligt inom 5-30sec.
- Den vätskefyllda nål sätts in i staven, som sedan klämmas mot mikromanipulator i 45 ° vinkel.
- Nålen visualiseras med 10x objektiv och är placerad i mitten av visningen planet nära fokalplanet med den grova mikromanipulator rattarna. Nålen är då upp ett par millimeter för att förhindra den från att skadas i senare steg (2.2.2) och sedan mikroskopet tillbaka pelaren trycks tillbaka.
- Trycket ökar genom att trycka in kolven 0,5-2CC.
- Mikroinjektion
- En petridish innehåller en cover-slip med en sårad monolager placeras på visning scenen.
- Mikroskopet tillbaka pelare dras fram mot en upprätt position, vilket gör att kondensorn vara anpassad och nålen att gå in i vätskan. Detta bör göras noggrant för att förhindra att nålen från att bryta ut på täckglas (se 2.1.4).
- Med hjälp av 10x målet, är centrum av korset såret identifierats och nålen är placerad ovanför de celler som ska injiceras.
- Förstoringen ökas genom att byta till 40x objektiv och nålen sänks och centreras med fininställning vreden på joysticken. Om bilden är ur fokus, måste man se till att det infallande ljuset är rätt linje (dvs Kölher belysning 9) med hjälp av en Bertrand lins (se 1.5.2).
- Injektion ska börja på ett hörn av såret korset och fortsatte längs ena kanten för enkel identifiering av injicerade cellerna under visualisering (se figur 1).
- Nålen sänks att få kontakt med kärnan. Man kan lätt se att en cell har injicerats med anmärkningsvärda förändringen i fas ljusstyrka som medföljer injektion.
- Om vätskan fyller upp hela cellen kan det tyda på att trycket är för högt och behöver sänkas.
- Om ingen förändring i fas ljusstyrka upptäcks, kan det tyda på att antingen mikroinjektion trycket inte är tillräckligt stark för att tränga igenom cellmembranet, eller att nålspetsen är tilltäppt. Detta kan vara resultatet av ett antal frågor bland annat: otillräckligt tryck, brister i nålen och blockering av nålspetsen med små partiklar. Sedan laddar varje nål i mikromanipulator är tidskrävande, och eftersom injektionen substratet är ofta mycket värdefulla, är det viktigt att maximera andelen nålar som effektivt kan användas för injektioner. Nedan följer en steg-för steg guide för att försöka låsa upp en igensatt nålspetsen. Efter varje steg bör man försöka att injicera 2-3cells att bedöma om hindret har tagits bort:
Åtgärd Syfte och mål 1 Justera fokus för att visa längden på nålspetsen. För att avgöra om det finns en uppenbar brist i nålen, eller om det finns en stor bit av partiklar blockerar spetsen. 2 Placera nålspetsen bredvid en flytande bit av partiklar i skålen. Om vätskan är spännande spetsen det borde uppröra partikeln utan det kommer i direkt kontakt med nålen. 3 Tryck kolven ända till slutet av sprutan Denna tillfälliga ökning av trycket bör klara alla hinder i spetsen. Efter kolven släpps bör man stiga på eget initiativ, om det inte är detta betyder tryck inte byggs upp i sprutan och du måste dra åt anslutningarna och / eller lägga till ytterligare vakuum fett. 4 Höj nålen ut ur cellen medIA Kraften att dra ut nålen ur vattenhaltigt medium kan hjälpa rubba hinder på spetsen av nålen. 5 Avlägsna kolven från sprutan helt och sätt i den igen. Detta ytterligare ökning av trycket kan krävas för att rensa nålspetsen. 6 Skrapa nålspetsen på en ren del av täckglas Denna ytterligare agiterar för partiklar i nålen och hjälper placera om den för att lindra obstruktion i spetsen. Starkare repor kan chip från slutet av spets, så att hinder för att gå ur nålen. 7 Ladda en ny nål
Ett annat vanligt problem är den gradvisa förlusten av tryck i nålen, som kräver täta kompensation genom att ytterligare trycka på kolven i sprutan. Ofta kan lägga ytterligare vakuum fett på sprutkolven hjälper till att hålla jämnare tryck. Men detta problem kan bero på läckage sambanden mellan sprutan och rör, röret och staven, eller staven och nålen. De flesta luftläckage kan tätas med Parafilm (Fisher) eller fett vid behov, även läckage mellan staven och nålen bara kan korrigeras genom att byta gummipackningen i staven. - Celler längs ett sår kanten är idag injiceras längs såret kant för en bestämd tidsperiod (10-15min). Med övning flera hundra celler kan injiceras under detta intervall.
- Efter mikroinjektion, är de celler inkuberas vid 37 ° C i en vävnadsodling inkubator för önskad tid före fixering. Om injicera DNA, transkription avbryts efter 20 minuter genom att behandla celler med α-amanitin (1μg/ml, Sigma-Aldrich) upplöst i tillväxt medier. Denna koncentration hämmar effektivt avskrift från idag injiceras plasmid (Figur 3).
- En enda nål kan återanvändas för att injicera olika täckglas, men nålen måste bytas ut när man ändrar typ av DNA eller RNA som är idag injiceras. När nålen tas bort från staven är ska kasseras och inte återanvändas.
- Döda eller flytande celler fastnar ibland till nålspetsen och kan störa mikroinjektion. Ta bort detta skräp från nålen, höja nålen ur vätskan genom att trycka tillbaka pelaren och sedan långsamt sätta in nålen tillbaka i vätskan genom att justera om pelaren till upprätt läge.
- För att få en noggrann mätning av mRNA nukleära exporten kinetik mätning bör separata prover fastställas till 0min, 15min, 30min, 60min och 120 min efter RNA mikroinjektion, eller efter α-amanitin behandling.
3. Cell fixering och färgning
- Cell fixering och Permeabilization
- Vid lämpligt tillfälle, är tillväxten media aspirerade och cellerna tvättas två gånger med 2 ml PBS lösning (137mm NaCl, 2.7mm KCl, 10mm Na 2 HPO 4, 2mm KH 2 PO 4, pH 7,4). Det är viktigt att hålla täckglasen fuktiga genom att minimera den tid de är inte nedsänkt i vätska.
- Cellerna är fasta genom att tillsätta 2 ml 4% paraformaldehyd (Electron Microscope Sciences) i PBS i minst 15 min i rumstemperatur.
- De fasta prover tvättas två gånger med PBS-lösning.
- Cellerna är permeabilized med 2 ml 0,1% Triton X-100 i PBS i minst 15 minuter i rumstemperatur.
- Proverna tvättas två gånger med PBS-lösning.
- FISK färgning
- Nästa proverna måste vara beredd på hybridisering. Cellerna tvättas två gånger med 1x SSC-lösning (150mm NaCl, 15mm natriumcitrat, pH 7,0) med 25-60% formimide. För den mängd formamid, använda samma koncentration som finns i hybridisering lösning (se 3.2.3).
- För att förbereda färgning kammare, är botten av en 150mm petridish täckt med vatten och en bit Parafilm är flöt på vattnet. Vattnet tas bort genom att vända skålen över, vilket gör att Parafilm att ansluta sig till botten av skålen. Luftbubblor manuelltflyttas.
- För varje täckglas ska färgas, 100μl droppar av hybridisering lösning (25-60% formamid, 100mg/ml dextransulfat, 1mg/ml E. coli tRNA, 5mm vanadyl riboside komplex i 1x SSC med sond utspätt 1:500) är pipetteras på parafilm. Observera att mängden formamid bör optimeras för viss fisk sond som används.
- Med hjälp av pincett, är ett täckglas bort från en 30mm petridish, sedan använda Whatman filterpapper (VWR) baksidan (cellfria sida) på täckglas torkas och överflödig buffert är onda från framsidan utan att torka den fasta celler. Den täckglas placeras sedan nedåt på FISH lösningen. Detta upprepas för varje täckglas.
- Efter att locket färgning kammaren igen, är proverna inkuberas i 5-18hrs vid 37 ° C.
- Tvätt och Montering av Stained Samples
- Flera tvätt kammare är tillverkade på samma sätt som färgning kammare (se 3.2.2).
- För varje täckglas är 1 ml tvättbuffert (1x SCC med 25-60% formamid) pipetteras på parafilm av tvätt kammaren. Återigen använder samma koncentration av formamid som finns i hybridisering lösning (se 3.2.3).
- För att ta bort täckglasen från färgning kammare, 1 ml tvättbuffert är pipetteras bredvid täckglas. Vätskan bör göras under varje prov genom kapillärkraft.
- Använd pincett, är täckglasen bort och vart placeras på droppen tvättbuffert och inkuberas i rumstemperatur i 5 minuter.
- Steg 3.3.2 till 3.3.4 upprepas ytterligare två gånger, så att varje täckglas tvättas totalt 3 gånger.
- Om RNA ska costained med lite protein genom immunofluorescens, se avsnitt 3.4.
- Diabilder tvättas med 70% etanol, och torkas med Kimwipes. För varje täckglas är 10-30 ìl av monteringslösning med DAPI (Fluoromount G, Södra Biotech) pipetteras på bilderna. Varje diabild kan rymma två täckglas.
- Använd pincett och Whatman filterpapper, är baksidan av täckglas torkade och överflödig vätska är ond från framsidan av täckglas utan att torka proverna. Varje täckglas placeras sedan ansiktet nedåt, på den droppe monteringslösning.
- Monterade prover kan förvaras vid 4 ° C.
- Immunofluorescens färgning
- Proverna skall tvättas två gånger med PBS för att ta bort formamid som kan störa ordentlig antikropp färgning.
- För varje täckglas, 50μl av primär antikropp lösning (1.0μg/ml antikropp, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml RNAse-fri BSA i PBS) är pipetteras på parafilm en tvätt kammare.
- Använd pincett är täckglas placeras cellen nedåt på den primära antikroppen lösning och får inkubera i rumstemperatur i 30min.
- För varje täckglas, två 1 ml droppar PBS pipetteras på parafilm en tvätt kammare.
- För att ta bort täckglasen från antikroppar färgningslösningen är 1 ml PBS pipetteras bredvid täckglas. Vätskan bör göras under varje prov genom kapillärkraft.
- Använd pincett, är täckglasen bort och vart placeras på den första droppe PBS för 5min och sedan placeras på den andra droppe PBS för en annan 5min.
- Steg 3.4.2 till 3.4.6 upprepas med fluorescerande sekundär antikropp lösning (1.0μg/ml antikropp, 0,1% TX-100, 0.1mg/ml BSA i PBS). Observera att eftersom injektionen markör och RNA är synliga i de gröna och röda kanalen, måste sekundär antikropp vara konjugerat till en kompatibel färgämne som Alexa647.
- Täckglas är monterade som i 3.3.7.
4. Imaging och kvantifiering
- Imaging
- En epifluorescensmikroskop används för att bilden cellerna efter injektionen. Injicerade cellerna kan lokaliseras genom att placera korset sår och identifiera celler med injiceras markör (OG-dextran).
- För varje cell observeras är en bild av det injicerade OG-dextran förvärvas. När bildbehandling idag injiceras mRNA är det viktigt att kvantifiering är begränsad till celler som fått> 90% av den injicerade vätskan (dvs dextran) i kärnan.
- En bild av RNA är då förvärvas. För att möjliggöra en noggrann mätning av RNA bör exponeringstiden mellan alla celler inom en viss tid kurs förblir konstant och ligger inom det dynamiska omfånget i kameran. Helst varje bild bör innehålla ett uninjected cell för att kunna korrekt beräkna bakgrundsfluorescens integreradensity (se 4.2.4).
- För att underlätta kvantifiering, kan en bild av DAPI fläcken också förvärvas. Även om immunofluorescens utfördes kan färgade proteinet också avbildas. Ett exempel på mRNA fördelning på olika punkter under en tidsperiod visas i figur 4. MRNA kodar ett utsöndrat protein och är därför riktade till akuten i COS-7 celler. Observera att ER-inriktning har verifierats av co-färgning av RNA med antikroppar mot TRAPα, bosatt ER protein 11.
- Kvantifiering
Detta kan göras med ett antal olika programvaror bildanalys paket. ImageJ programvara lämpar sig väl för kvantifiering av cellulära mRNA-distributionen eftersom den kan användas för att manuellt separata nukleära och cytoplasmiska fraktioner, kan det mäta den genomsnittliga fluorescens av dessa fraktioner, och dess utdata lätt kan kopieras och klistras in i andra program, t.ex. Microsoft Excel.- Bilder motsvarande FISK, OG-dextran och DAPI fluorescens öppnas och slås samman med hjälp av bilder att stapla verktyg.
- I antingen DAPI eller dextran lager tröskeln verktyg används för att isolera det område som motsvarar de idag injiceras kärnan. Denna fraktion har valts med Wand verktyget, och efter att ha flyttat till FISH lager området (A NUC) och genomsnittligt / medelintensitet (F NUC) redovisas enligt mätverktyget.
- Cellen omkrets beskrivs med hjälp av verktyget Freehand val, och även på FISH lagret området (A Tot) och genomsnittligt / medelintensitet (F Tot) redovisas enligt mätverktyget. Om din cell fluorescens är betydligt intensivare än i bakgrunden, kan du använda Threshold verktyg istället för Freehand urval verktyg för att beskriva önskad cell.
- Använda Rektangulär valet funktion, är en låda dras över en uninjected cell och medelvärdet / medelintensitet (F Tillbaka) registreras.
- Alla mått är kopieras till ett Excel-kalkylblad.
- Exporterade mRNA beräknas med följande ekvation:
En NUC Område av kärnan En Tot Området av hela cellen F NUC Genomsnittlig fluorescens vid kärntekniska fraktionen F Tot Genomsnittlig fluorescens av hela cellen bråkdel F Tillbaka Genomsnittlig fluorescens en untransfected cell
För varje tidpunkt i genomsnitt% Export beräknas och plottas över tiden. - mRNA stabilitet beräknas genom att markera det genomsnittliga totala mRNA fluorescens (A Tot x (F Tot - F Tillbaka)) över tiden. Vanligtvis finner vi att mängden av mRNA varierar kraftigt mellan cellerna och mellan täckglas. Detta kan bero på bristande överensstämmelse mellan räntor nål flöde och mellan effektivitet FISH färgning.
Figur 1. Mikroinjektion täckglas. Celler odlas tills de är 70-90% konfluenta sedan sårade vertikalt och horisontellt med hjälp av en 200μl spets plastpipetten. Från och med över såret, celler injiceras längs ett sår kanten (pilen).
Figur 2. Syringe regulator. A) Flödesschema som visar hur sprutan regulatorn är monterad. B) Schematisk bild av den monterade apparaten. C) Ett fotografi av den monterade sprutan regulatorn.
Figur 3. Effekter av α-amanitin på transkription av injiceras plasmid-DNA. NIH3T3 fibroblast celler, som förbehandlats med varierande koncentrations av α-amanitin, injicerades med t-FTZ-Δi plasmid DNA och OG-konjugerade 70kD dextran. Injiceras celler inkuberades vid 37 ° C i 1 timme och sedan fasta och färgas för t-FTZ-Δi mRNA med hjälp av en specifik FISH probe6. Varje rad motsvarar en enda synfält avbildas för OG-70kDa dextran och t-FTZ-Δi mRNA. Observera att höga men inte låga, hämmade koncentrationer av läkemedlet helt produktion av t-FTZ-Δi avskrift. Skala bar = 15μm.
Figur 4. Tid under mRNA nukleära exporten. Var COS-7 celler injiceras med t-FTZ-Δi plasmid DNA och OG-konjugerade 70kD dextran. 30 min efter injektion celler behandlades med α-amanitin och inkuberas vid 37 ° C under den angivna tidpunkter. Cellerna var då fasta och färgas med sond mot t-FTZ-Δi mRNA och med antikroppar mot ER markör TRAPα. Varje rad motsvarar ett enda fält av celler. A) mRNA Distribution Efter en mikroinjektion tidsförloppet. B) Ett spränga av 120 min tid punkt från (A) visar samtidig lokalisering av t-FTZ-Δi mRNA och ER. En överlagring av t-FTZ-Δi mRNA (grön) och TRAPα (röd) färgning visas i den högra panelen. Skala barer = 15μm.
Discussion
Mikroinjektion är ett kraftfullt verktyg som kan användas för att studera ett antal olika cellulära processer. Till skillnad från konventionella celler transfektion, gör mikroinjektion forskaren att effektivt införa nukleinsyror i cellulär kärnor inom ett mycket smalt tidsram. Som ett resultat kan man utföra kinetiska analyser såsom fastställande av de kurser av mRNA export, mRNA lokalisering, och proteinsyntes. Eftersom tidsramen för experimentet är relativt kort, kan man utsätta celler för toxiska substanser inom kort tidsperspektiv utan att ådra pleiotropa effekter. Dessutom kan hämmande eller stimulerande föreningar som dominerande negativa proteiner, co-injicerade med nukleinsyror. Slutligen microinjections undvika kravet på transfektion reagens, som ofta är giftiga för cellerna och kan störa olika funktioner i cellen.
mRNA vs plasmid-DNA injektioner
Valet av nukleinsyra att injicera beror på en rad överväganden. Efter plasmid-DNA injektion, RNA-polymeras II inte bara syntetiserar mRNA, men också rekryterar protein faktorer till den framväxande avskriften 12,13. Eftersom dessa faktorer styr händelser såsom mRNA-bearbetning, kärnkraft export och cytoplasmiska lokalisering kan plasmid DNA-injektioner kan användas för att bedöma hur transkriptionen är kopplad till nedströms processer. Även om transkription kan kopplas till kärnkraft exportera 14, har vi funnit att injiceras mRNA exporteras något snabbare än in vivo transkriberat mRNA 6. Skälen till detta är inte klart just nu, men detta resultat kan tyda på att så nyligen syntetiserade mRNA framträder RNA-polymeras II, kan det vara bundet i komplex som fördröja kärnkraft export.
Det finns vissa fördelar med mRNA injektioner. Först har forskaren inte använda RNA-polymeras-hämmare, vilket kan påverka hur celler reglerar den totala metabolismen av RNA. För det andra kan RNA ändras in vitro före injektion. Till exempel kan mRNA syntetiseras med olika 5-mössa analoger eller poly (A) svans längder för att kunna bedöma hur dessa funktioner påverkar nukleära exporten 6. För det tredje kan det exakta beloppet av RNA som injiceras vara ungefär uppskattas. Efter det protokoll som beskrivs ovan, uppskattar vi att cirka 20.000 till 50.000 molekyler injiceras i varje kärna, som är relativt litet i jämförelse med det totala antalet utskrifter i en typisk däggdjursceller (400 tusen till 850 tusen molekyler) 15. Den största nackdelen med mRNA injektioner är att under mikroinjektion, är några läckage av injektionsvätska i cytoplasman oundviklig. Sedan mRNA injiceras direkt i cytoplasman är stabil över långa perioder (A. Palazzo, opublicerad observation), måste extra försiktighet iakttas för att välja vilka celler kvantifieras. Generellt vi analyserar celler som fått> 90% av injektionsvätska i kärnan, enligt bedömning av fördelningen av OG-dextran.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Vi vill tacka E. Gomes för användbara råd och A. Wilde för att tillåta oss att använda olika utrustning. Detta arbete stöddes av ett bidrag till AFP från den kanadensiska Institute for Health Research (FRN 102.725).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Injection buffer | Sigma-Aldrich | 140 mM KCl and 10 mM HEPES, pH 7.4 | |
| Oregon Green 488-70kD Dextran | Invitrogen | D7173 | Stock of 10mg/ml in injection buffer can be stored for longs periods of time at -80°C |
| Borosilicate capillary tubes | World Precision Instruments, Inc. | 1B100F-4 | |
| Gel loading pipette tips for loading injection needles | Eppendorf | 022351656 | |
| Microscope | Nikon Instruments | Eclipse Ti-S | |
| Micromanipulator | Narishige International | NT-88-V3MSH | |
| Syringe for injection | BD Biosciences | 512311 | |
| PBS Buffer | Sigma-Aldrich | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4 | |
| SSC Buffer | Sigma-Aldrich | 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4 | |
| 4% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15686 | Stock of 37% Paraformaldehyde is diluted in PBS |
| 0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 28314 | Stock of 10% Triton X-100 is diluted in PBS |
| Formamide | Fisher Scientific | F84-1 | |
| Dextran sulfate | Fisher Scientific | BP1585-100 | |
| E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | R1753 | |
| Vanadyl riboside complex (VRC) | Sigma-Aldrich | R3380 | |
| Whatman filter paper | VWR international | 28298-020 | |
| Vibration control table | Kinetic Systems | 5702E-3036-21 | |
| Fluoromount G | SouthernBiotech | 0100-20 | |
| α-amanitin | Sigma-Aldrich | A2263 | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Vacuum Grease | Dow Corning | 695400008 | |
| T7 RNA Polymerase | New England Biolabs | M0251S | |
| Poly(A) Polymerase | Ambion | AM1350 | |
| Hybridization Buffer | Sigma-Aldrich | 100mg/ml dextran sulfate, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM sodium citrate, 0.5mg/ml E. coli tRNA, 60% formamide |
References
- Luo, M. J., Reed, R. Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).
- Bossie, M. A., Silver, P. A. Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast. Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).
- Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans. Genes Dev. 22, 66-78 (2008).
- Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells. Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).
- Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts. J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).
- Palazzo, A. F. The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA. PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).
- Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).
- Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling. Science. 303, 836-839 (2004).
- Keller, H. E. Proper alignment of the microscope. Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).
- Mathews, D. H. Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).
- Görlich, D. The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents. J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).
- Perales, R., Bentley, D. "Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions. Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).
- Buratowski, S. Progression through the RNA polymerase II CTD cycle. Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).
- Maniatis, T., Reed, R. An extensive network of coupling among gene expression machines. Nature. 416, 499-506 (2002).
- Carter, M. G. Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray. Genome Biol. 6, 61-61 (2005).
