整列エレクトロスピニングの繊維は、in vitroで神経細胞の成長を指示し、神経再生の足場の潜在的なコンポーネントです。我々は、エレクトロスピニングの繊維基材と初代ラットE15感覚(DRG)と運動ニューロンの無血清培養を調製するための手順を説明します。免疫細胞による神経細胞の可視化も含まれています。
エレクトロスピニングは、ナノスケールの繊維のマイクロに生成するためのテクニックです。繊維は非常に完全にランダムに整列から、アライメントの程度の差でエレクトロスピニングすることができます。さらに、繊維は、ポリ- L -乳酸(PLLA)のような生分解性ポリマーを含む様々な材料、から紡糸することができます。これらの特性は、組織工学における足場の様々なアプリケーションに適したエレクトロスピニングの繊維を作る。我々の焦点は、神経再生のための整列エレクトロ繊維の使用になります。我々は以前にアラインエレクトロPLLA繊維は、in vitroの両方の一次感覚と運動ニューロンの突起伸長を指示することを示している。我々はできるかぎり生体に見られるモデル実際の神経細胞への生体材料を評価する際に、初代培養細胞系の使用が不可欠であることを維持する。ここで、我々は、エレクトロスピニングの足場に、繊維状の足場と文化背根神経節の外植片だけでなく、解離性感覚および運動ニューロンをelectrospinする我々の研究室で使用される技術について説明します。しかし、エレクトロスピニングおよび/または文化ここに示す手法は、容易に他のアプリケーションでの使用に適合している。
このプロトコルは、いくつかの重要なステップがあります。最初はエレクトロ繊維基材の適切な生産を伴います。液体培地では、PLLA繊維、PLGAフィルムおよびPLGAの堀は、単一ユニットとしてガラス製カバースリップから分離されます。 PLGAが省略された場合、PLLA繊維は、平らなシートは残りません – 彼らが使用不能にもつれに丸くなっています。従って、PLGA膜は培養中に光ファイバのアライメントを維持するために適切な基質として含まれています。堀は、繊維がしっかりとPLGA膜に固定されており、フィルムに構造的な剛性を追加することを保証するために両方のスピンの後に追加されます。基板は、固定染色し、実装時に操作される際に堀にも便利なハンドルとして機能します。粉砕は2番目に重要なステップです。あらゆる努力が泡の形成を回避するためになされるべきである。さらに、我々は、ファイアーポリッシュピペットはこのステップに使用される非常に高い利回りを得ている。研磨発生させるには、ブンゼンバーナーを点灯し、ピペットに電球を取り付けます。継続的に絞ると電球を放出しながら炎を迅速に2-3回をピペットの先端を渡す – ピペットを通る空気の流れが完全に閉じてから先端を防ぐことができます。穴が開いたままとエッジは使用前に少し丸み表示されるようになるようにピペットの先端を調べます。
エレクトロスピニングは、非常に汎用性の高いプロセスです。エレクトロスピニングのパラメータは、形態の様々な繊維を製造するように変更することができます。タンはら (2005)詳細PLLAエレクトロ繊維の直径に影響を与えるパラメータの体系的研究を。 Wang ら (2009)エレクトロPLLA繊維のアラインメントに影響を与えるパラメータの詳細な調査を提示。
The authors have nothing to disclose.
NIH K08 EB003996
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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PLLA | Boehringer Ingelheim | Resomer L210 | ||
PLGA 85:15 | Sigma | 43471 | ||
L15 | Gibco | 11415 | ||
Albumin | Sigma | A2289 | ||
Apo-transferrin | Akron | AK8227 | ||
Biotin | Fisher | AC 23009-0010 | ||
Galactose | Sigma | G0625 | ||
Progesterone | Sigma | P7556 | ||
Putrescine | Sigma | P5780 | ||
Selenium | Sigma | S9133 | ||
β-estradiol | Sigma | E 1132 | ||
Hydrocortisone | Sigma | H0396 | ||
Catalase | Sigma | C40 | ||
Superoxide dismutase | Sigma | S4636 | ||
Neurobasal | Gibco | 21103-049 | ||
PSN | Gibco | 15640 | ||
L-glutamine | Nalgene | 1680149 | ||
Trypsin | Nalgene | 1689149 | ||
Fetal bovine serum | Gibco | 26140 | ||
Optiprep | Accurate | 2011 | ||
PLL | Sigma | P4832 | ||
Fibronectin | Sigma | F 4759 | ||
Laminin | Invitrogen | 23017-015 | ||
B27 | Gibco | 17504-044 | ||
BSA | Sigma | A7906 | ||
Anti-TuJ1 | BD Biosciences | 556321 | ||
Anti-neurofilament | Millipore | AB1987 | ||
Anti-S100 | Sigma | S2532 | ||
Anti-NGFR p75 | Sigma | N3908 | ||
Normal goat serum | Sigma | G6767 | ||
Triton X-100 | Sigma | T9284 | ||
Sodium azide | Sigma | S8032 | ||
Carbon tape | Ted Pella | 13073-1 | ||
Prolong Gold +DAPI | Invitrogen | P36931 |