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Summary
छिड़काव decellularization पूरे जिगर scaffolds है कि अंग बाह्य मैट्रिक्स संरचना और microarchitecture बरकरार रखती का उत्पादन करने के लिए एक उपन्यास तकनीक है. इस के साथ साथ, पूरे अंग hepatocytes के साथ छिड़काव decellularization और बाद repopulation का उपयोग scaffolds तैयार करने की विधि वर्णित है. कार्यात्मक और transplantable जिगर grafts इस तकनीक का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है.
Abstract
जिगर एक जटिल अंग है जो पोषक तत्वों और ऑक्सीजन और अपशिष्ट को हटाने के के प्रसव के लिए लगातार छिड़काव की आवश्यकता है क्रम में एक जीवित रहने के है . विश्राम या ऊतक इंजीनियरिंग और तकनीक microfabrication का उपयोग दृष्टिकोण के आधार के साथ जिगर microstructure नकल के प्रयास अभी तक सफल नहीं किया गया है इस डिजाइन की चुनौती वजह से. इसके अलावा, सिंथेटिक जिगर ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों के लिए scaffolds बनाने के लिए इस्तेमाल किया biomaterials विशेष सेल बाध्यकारी रूपांकनों है कि उचित सेल 2 कार्यों को प्रेरित होगा की कमी के कारण ऊतकों और बड़े हिस्से में उत्थान मरम्मत उत्प्रेरण में सीमित किया गया है. Decellularized देशी ऊतकों जैसे रक्त दूसरे हाथ पर 3 और 4 त्वचा जहाजों ऊतक इंजीनियरिंग में कई आवेदन मिल गया है, और चुनौतियों में से कुछ के लिए एक व्यावहारिक समाधान प्रदान की. decellularized देशी मैट्रिक्स के लाभ यह है कि यह एक हद तक, मूल संरचना, और microstructure बरकरार रखती है, इसलिए सेल लगाव और 5 पुनर्गठन बढ़ाने.
इस काम में हम तरीकों जिगर के छिड़काव decellularization, ऐसी है कि एक अक्षुण्ण जिगर bioscaffold कि प्रमुख रक्त वाहिकाओं की संरचना को बरकरार रखे हुए प्राप्त की है प्रदर्शन करने के लिए का वर्णन. इसके अलावा, हम वयस्क प्राथमिक hepatocytes साथ इन bioscaffolds recellularize, एक जिगर भ्रष्टाचार है कि इन विट्रो में कार्यात्मक है बनाने के तरीकों का वर्णन है, और पोत का उपयोग vivo में प्रत्यारोपण के लिए आवश्यक है.
Protocol
1. लिवर Decellularization
- पोर्टल शिरा का उपयोग cannulation और 18 गेज कैथेटर के साथ एक चूहा जिगर हार्वेस्ट. अवर और बेहतर रग Cava खुला छोड़ दें. फॉस्फेट में अंग हाइड्रेटेड रखें खारा (पीबीएस) के एक 10 सेमी पेट्री डिश में buffered.
- एक छिड़काव प्रणाली है कि 8 लीटर जलाशय, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और एक बुलबुला जाल होते हैं सेट.
- फॉस्फेट के साथ छिड़काव प्रणाली भरें खारा buffered और इसे 10 मिनट के लिए चल रहा रखने. एक 10 सेमी पेट्री डिश में पीबीएस भरें और कम फॉस्फेट के प्रवाह की दर 1 एमएल / मिनट के लिए खारा buffered.
- ध्यान फॉस्फेट को काटा जिगर हस्तांतरण खारा भरा 10 सेमी पेट्री डिश buffered.
- पीबीएस छिड़काव के साथ रात भर जारी रखें.
- 0.01% (w / v) सोडियम dodecyl सल्फेट 5 मिनट के लिए (एसडीएस) आसुत जल में के साथ छिड़काव शुरू करो.
- 1 घंटे के लिए पीबीएस साथ Perfuse.
- 1.6 कदम और 1.7 तीन गुना अधिक 10, 15 और 20 मिनट प्रत्येक समय में एसडीएस छिड़काव समय बढ़ दोहराएँ.
- 24 घंटे के लिए 0.01% (w / v) एसडीएस के साथ छिड़काव जारी रखें.
- 24 घंटे के लिए 0.1% (w / v) एसडीएस के साथ छिड़काव जारी रखें.
- 3 घंटे के लिए 0.2% (w / v) एसडीएस के साथ Perfuse.
- 3 घंटे के लिए 0.5% (w / v) एसडीएस के साथ Perfuse.
- 15 मिनट के लिए आसुत जल के साथ Perfuse.
- 1% (w / v) आसुत जल में ट्राइटन X-100 के साथ 30 मिनट के लिए किसी भी बाध्य nucleic एसिड को हटाने के लिए Perfuse.
- Decellularized जिगर (DLM) मैट्रिक्स, पीबीएस के साथ 2 घंटे के लिए perfuse धोने के लिए.
- वैकल्पिक: मंझला पालि के अलावा सभी lobes बांटना.
- एक साफ और सील पेट्री 4 ओ सी में पीबीएस में उपयोग करने के लिए तैयार (चित्रा 1) जब तक लथपथ पकवान में DLM स्टोर.
- DLM बाँझ: 1) बाँझ पीबीएस 4 ओ सी में 0.1% (v / v) peracetic एसिड और 4% (v / v) इथेनॉल और 3 घंटे के लिए सेते युक्त साथ DLM फ्लश 2) बाँझ पीबीएस दो बार के साथ धोएं. 3) बाँझ पीबीएस 2% पेनिसिलिन - स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10ug / एमएल gentamicin, और 2.5 स्नातकीय / एमएल amphotericin बी स्टोर recellularization प्रयोगों के लिए उपयोग करने के लिए तैयार है जब तक 4 ओ सी में एक ही समाधान में decellularized जिगर युक्त के साथ धोएं.
2. Decellularized लिवर मैट्रिक्स के Recellularization
- एक छिड़काव प्रणाली है कि एक छिड़काव चैम्बर, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप और बाँझ की शर्तों के तहत एक बुलबुला जाल होते हैं सेट. मध्यम संस्कृति, उदाहरण के लिए, उच्च ग्लूकोज (सिग्मा) DMEM, 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (Hyclone), 100 यू एमएल -1 पेनिसिलिन, और 100 μg एमएल -1 स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen) 200 एमएल के साथ छिड़काव प्रणाली भरें.
- छिड़काव कक्ष में decellularized जिगर मैट्रिक्स प्लेस और छिड़काव प्रणाली पोर्टल शिरा प्रवेशनी के माध्यम से DLM जबकि 5 एमएल / मिनट पंप पर चल रहा है किसी भी हवाई बुलबुले के गठन से बचने कनेक्ट.
- 30 मिनट के लिए DLM के माध्यम से मध्यम के छिड़काव की अनुमति दें.
- कम से कम 90% की व्यवहार्यता के साथ एक वयस्क चूहे से प्राथमिक hepatocytes अलग.
- छिड़काव प्रणाली में प्रवाह बंद करो और धीरे धीरे छिड़काव प्रणाली में बुलबुला जाल के माध्यम से 50 लाख hepatocytes (संस्कृति के माध्यम से 1-3 एमएल) इंजेक्षन.
- 10 एमएल / मिनट प्रवाह प्रारंभ करें और 10 मिनट के लिए मध्यम recirculate.
- 2.5 और 2.6 कदम दोहराएँ जब तक कुल 200 मिलियन कोशिकाओं के DLM (चित्रा 2) 6 में पेश कर रहे हैं.
- एक बार सभी कोशिकाओं DLM में perfused हैं, चार 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूबों और अपकेंद्रित्र में 10 मिनट के लिए 600 rpm पर perfusate इकट्ठा. Supernatants त्यागें और एक एकल ट्यूब में छर्रों इकट्ठा. Trypan नीले बोने की दक्षता का निर्धारण करने के लिए बहिष्करण के माध्यम से कोशिकाओं और व्यवहार्यता की संख्या का निर्धारण करते हैं.
3. Recellularized लिवर भ्रष्टाचार के इन विट्रो संस्कृति में
- एक छिड़काव प्रणाली है कि एक छिड़काव चैम्बर, क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप, oxygenator बाँझ शर्तों (चित्रा 3) के तहत और एक बुलबुला जाल होते सेट. संस्कृति के माध्यम के 50 एमएल के साथ छिड़काव प्रणाली को भरें, उदाहरण के लिए, विलियम्स 'ई (सिग्मा), 5% भ्रूण गोजातीय सीरम (Hyclone), 0.5 यू एमएल -1 (एली लिली) इंसुलिन, 20 एनजी एमएल -1 EGF ( Invitrogen) , 14 एनजी एमएल -1 (Bedford प्रयोगशालाओं) ग्लूकागन, 7.5 μg एमएल -1 (Pharmacia) hydrocortisone, 100 यू एमएल -1 पेनिसिलिन, और 100 एमएल -1 स्ट्रेप्टोमाइसिन (Invitrogen) μg.
- छिड़काव कक्ष में recellularized जिगर भ्रष्टाचार प्लेस और छिड़काव प्रणाली पोर्टल शिरा प्रवेशनी के माध्यम से DLM जबकि 5 एमएल / मिनट पंप पर चल रहा है किसी भी हवाई बुलबुले के गठन से बचने कनेक्ट.
- Aseptically छिड़काव चैम्बर बंद और संस्कृति के दौरान किसी भी रिसाव से बचने कसकर सील.
- एक मशीन है कि 37 ओ सी और 10% सीओ छिड़काव प्रणाली स्थानांतरण 2 और 15 एमएल / मिनट छिड़काव प्रवाह की दर में वृद्धि.
- एक 95% 2 हे और 5% सीओ 2 गैस मिश्रण टैंक oxygenator कनेक्ट और गैस प्रवाह दर 0.5 लीटर / मिनट के लिए सेट . यह approxima के एक ऑक्सीजन की आंशिक दबाव को प्राप्त करने चाहिएtely 400 mmHg.
- संस्कृति संस्कृति के माध्यम से दैनिक परिवर्तन के साथ 10 दिनों तक जारी रख सकते हैं. संस्कृति के माध्यम albumin, यूरिया, और कुल पित्त एसिड स्राव के रूप में इस तरह के भ्रष्टाचार के जिगर कार्यों की निगरानी के लिए दैनिक नमूना हो सकता है. संस्कृति की अवधि के अंत में, recellularized जिगर भ्रष्टाचार आणविक और histological विश्लेषण के लिए नमूना हो सकता है.
4. प्रतिनिधि परिणाम:
एक चूहा जिगर की पूरी decellularization लगभग 72 घंटे लगते हैं वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग. परिणामस्वरूप मैट्रिक्स तंतुमय कोलेजन के 100%, glycosaminoglycans के 50% और देशी जिगर के डीएनए (तालिका 1) 6 का केवल 5% को बरकरार रखे हुए है. मैट्रिक्स के संवहनी संरचना संरक्षित है के रूप में जंग कास्टिंग और स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (चित्रा 4) विश्लेषण 6 द्वारा evidenced. DLM भीतर संवहनी microarchitecture की उपस्थिति 96% की दक्षता और अपने इन विट्रो संस्कृति में के लिए बाद छिड़काव के साथ कोशिकाओं के साथ अपनी repopulation सुविधा है. recellularized जिगर भ्रष्टाचार इन विट्रो में 10 दिनों के लिए किया जा सुसंस्कृत हो सकता है और उचित जिगर के रूप में albumin, यूरिया, और कुल पित्त अम्ल (चित्रा 5) स्राव 6 के माध्यम से पुष्टि कार्यों को प्रदर्शित करता है.
चित्रा 1 decellularization प्रक्रिया के अंत में जिगर मैट्रिक्स Decellularized. (क) पूरे जिगर (ख) लकीर के बाद मंझला लोब.
चित्रा 2 DLM के recellularization की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.
चित्रा 3 छिड़काव recellularized जिगर भ्रष्टाचार के इन विट्रो संस्कृति में के लिए सिस्टम सेटअप .
चित्रा 4. Microvascular संरचना decellularized जिगर मैट्रिक्स में बनाए रखा है . ) एक सामान्य जिगर ख) एक decellularized जिगर, (लाल) पोर्टल और शिरापरक vasculature (नीला) की जंग डाली छवियाँ. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी छवियों DLM ग) एक पोत, घ) एक पित्त नली की तरह छोटे (तीर) वाहिकाओं, स्केल सलाखों (a, b) 5 (मिमी ग, घ) 20 सुक्ष्ममापी विशेषता अनुभाग.
चित्रा 5 लिवर के दौरान recellularized जिगर भ्रष्टाचार के इन विट्रो छिड़काव संस्कृति में विशिष्ट कार्य करता है. ) albumin (.५२४९ = पी) स्राव, ख) यूरिया उत्पादन (पी .५२७१ =) और ग) कुल पित्त अम्ल स्राव (= पी .0114). 10 घ संस्कृति अवधि में एक = 0.01 फ्राइडमैन के परीक्षण के द्वारा प्रयोग और नियंत्रण के बीच अंतर के सांख्यिकीय विश्लेषण किया गया था. त्रुटि सलाखों sem (n = 3) का प्रतिनिधित्व करते हैं.
| ताजा livera | Decellularized जिगर एक मैट्रिक्स | पी मान | ताजा जिगर का% | |
| n = 4 | n = 8 | |||
| कोलेजन | 0.07 ± 0.01 | 0.08 ± 0.03 | 0.56 | 114% |
| (छ जिगर प्रति मिलीग्राम) | ||||
| Glycosaminoglycans | 73.1 ± 6.7 | 34.2 ± 2.9 | 0.004 | 47% |
| (छ जिगर प्रति मिलीग्राम) | ||||
| डीएनए | 14.9 ± 5.6 | 0.44 ± 0.08 | 10 3.3 -+५ | 2.9% |
| (छ जिगर प्रति मिलीग्राम) |
तालिका 1. Decellularized जिगर मैट्रिक्स जैव रासायनिक संरचना देशी जिगर की तुलना में.
एक मान ± sem मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं
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Discussion
छिड़काव decellularization यहाँ वर्णित विधि पूरे जिगर पाड़ है कि वही सकल संरचना और देशी जिगर के संवहनी microarchitecture है पैदा करता है. पाड़ एक बाह्य मैट्रिक्स देशी जिगर के लिए इसी तरह की संरचना है. recellularization विधि के साथ इन विट्रो संस्कृति परीक्षण अवधि के दौरान उच्च दक्षता और कोशिकाओं में कोशिकाओं व्यवहार्य और कार्यात्मक रहते पाड़ के repopulation प्राप्त होता है . Recellularized जिगर भ्रष्टाचार में nonparenchymal कोशिकाओं के साथ इसके अलावा, हम कल्पना है कि recellularized जिगर भ्रष्टाचार दवा चयापचय, उत्थान और विकास जैसे विभिन्न जिगर कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक मंच के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. इसके अलावा, recellularized भ्रष्टाचार नैदानिक आवेदन मिल जाए, क्योंकि यह संभवतः रक्त परिसंचरण के एक प्राप्तकर्ता जानवर भ्रष्टाचार 6 संवहनी संरचना की उपस्थिति के लिए धन्यवाद करने के लिए कनेक्शन के माध्यम से कर सकते हैं प्रतिरोपित किया जा सकता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों के डिजाइन के लिए इन विट्रो छिड़काव कक्ष में जैक Milwid शुक्रिया अदा करना होगा . यह काम अमेरिकी एनआईएच, R01DK59766 और R01DK084053 से R00DK080942 मेरे, अनुदान कू, अमेरिकी NSF कू और BEU के लिए बच्चे के लिए श्राइनर्स हॉस्पिटल CBET - 0,853,569 (अनुदान नहीं 8503.) द्वारा समर्थित किया गया. हम भी बच्चों के लिए समर्थन और श्राइनर्स हॉस्पिटल स्वीकार करते हैं.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | EW-07523-80 | |
| Masterflex L/S Standard pump head | Cole-Parmer | EW- 07013-81 | |
| Bubble trap | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 |
References
- Kulig, K. M., Vacanti, J. P. Hepatic tissue engineering. Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation. Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).
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- Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. , (2010).
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बायोइन्जिनियरिंग 48 अंक लिवर बाह्य मैट्रिक्स decellularization recellularization hepatocytes bioreactorErratum
Formal Correction: Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011.
Citeable Link.
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Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.
