全肝臓の細胞化とRecellularization

Summary

灌流細胞化は、臓器の細胞外マトリックスの組成とマイクロアーキテクチャを保持する全体の肝臓の足場を生成する新規な手法です。ここで、肝細胞で灌流細胞化およびその後の再投入を使って臓器全体の足場を準備する方法について説明する。機能性と移植肝移植は、このテクニックを使用して生成することができます。

Abstract

肝臓は^1を生き残るために栄養と酸素と廃棄物の除去の配信のための一定の灌流を必要とする複雑な器官です。組織工学と微細加工技術を用いてアプローチ上の理由で肝臓の微細構造を再作成したり、模倣するための努力は、この設計上の課題のためにこれまでのところ成功していない。さらに、肝組織工学のアプリケーションのために足場を作成するために使用される合成生体材料は、適切な細胞機能^2を誘導する特異的細胞結合モチーフの不足のため大部分の組織の再生と修復を誘導することに限定されている。一方、脱細胞ネイティブ組織など血管³と皮膚^4は、組織工学における多くのアプリケーションを発見した、との課題のいくつかの実用的なソリューションを提供している。脱細胞ネイティブマトリックスの利点は、それ故に細胞接着と組織再編^5を高め、ある程度、元の組成、および微細構造に、保持されることが。

本研究では、主要な血管の構造を保持する無傷の肝臓bioscaffoldが得られるようなことが肝臓の灌流-細胞化を実行するメソッドを記述します。さらに、我々はin vitroで機能的な肝臓の移植片を作成し、成人原発性肝細胞でこれらのbioscaffoldsをrecellularizeする方法を説明し、in vivoでの移植のために必要な血管アクセスを持っています。

Protocol

1。肝臓の細胞化

1. 門脈の使用カニュレーションと18ゲージのカテーテルを用いてラットの肝臓を収穫。劣ると上大静脈開いたままにしておきます。リン酸塩で臓器が水分を保つ10cmのペトリ皿に（PBS）緩衝生理食塩水。
2. 8リットルのタンク、蠕動ポンプとバブルトラップで構成されて灌流システムを設定します。
3. リン酸塩で灌流系を埋める緩衝生理食塩水、それが10分間実行し続ける。 10cmのシャーレにPBSを満たし、リン酸の流量を減らすには、1mL /分に緩衝生理食塩水。
4. 慎重にリン酸塩に収穫された肝臓を転送すると、生理食塩水充填した10cmのペトリ皿をバッファ。
5. 一晩PBSで灌流に進みます。
6. 5分間蒸留水で0.01％（w / v）のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）で灌流を開始します。
7. 1時間PBSで灌流。
8. 各時点で10、15および20分にSDSの灌流時間を増加させるステップ1.6および1.7を3回繰り返します。
9. 24時間では0.01％（w / v）のSDSで灌流を続ける。
10. 24時間0.1％（w / v）のSDSで灌流を続ける。
11. 3時間で0.2％（w / v）のSDSを灌流。
12. 3時間0.5％（w / v）のSDSを灌流。
13. 15分間蒸留水で灌流。
14. バインドされた核酸を除去するために30分間1％（w / v）のTriton X - 100を蒸留水にして灌流。
15. 脱細胞肝行列（DLM）、2時間PBSで浸み込ませるを洗う。
16. オプション：中葉を除くすべての葉を切除。
17. （図1）を使用する準備ができるまで^4℃でPBSに浸した清潔な密閉シャーレにDLMを保管してください。
18. DLMを殺菌するには：1）滅菌PBSで^4℃で0.1％（v / v）の過酢酸及び4％（v / v）の3時間のためのエタノールとインキュベートを含むでDLMをフラッシュ2）滅菌PBSで2回洗浄する。 3）滅菌PBS、2％ペニシリン-ストレプトマイシン、10ug / mLのゲンタマイシン、および2.5 ug / mlとアムホテリシンBストアrecellularizationの実験に使用するまで^4℃で同じ溶液中で脱細胞肝臓を含むで洗浄する。

2。脱細胞肝マトリックスのRecellularization

1. 灌流チャンバー、滅菌条件下で蠕動ポンプとバブルトラップで構成されて灌流システムを設定します。培地、例えば、高グルコースDMEM（Sigma社）、10％ウシ胎児血清（Hyclone、）、100 U mL ^-1のペニシリン、および100μg/mlのmL ^-1のストレプトマイシン（Invitrogen社製）200mlで灌流系を埋める。
2. 灌流チャンバ内の脱細胞肝臓の行列を置き、ポンプは、気泡の形成を避けるために、5 mL / minの時に実行中に門脈カニューレを介して灌流システムにDLMを接続する。
3. 30分間DLMによって培地の灌流を許可する。
4. 少なくとも90％の生存率と成熟ラットからの初代肝細胞を分離する。
5. 灌流系で流れを止め、徐々に気泡トラップを介して灌流システムに5000万肝細胞を（培地1-3 mLの）注入する。
6. 10mL /分でフローを開始し、10分のための媒体を再循環させる。
7. 2億セルの合計がDLM（図^2）6に導入されるまで、手順2.5と2.6を繰り返します。
8. 一度、すべての細胞がDLMに灌流される、10分間600rpmで4つの50 mlの遠心管と遠心分離機に灌流液を収集する。上清を捨て、一つのチューブにペレットを収集する。播種の効率を決定するためにトリパンブルー排除を経由して細胞と生存率の数を決定します。

3 Recellularized肝臓移植片のin vitro培養

1. 灌流チャンバーから構成される灌流系、蠕動ポンプ、人工肺と無菌条件下での泡のトラップ（図3）を設定します。培地50 mLで灌流系を埋める、など、ウィリアムズ'E（シグマ）、5％ウシ胎児血清（Hycloneは、）、0.5 U mL ^{-1のインスリン} （イーライリリー）、20ngのmL ^-1の EGF（インビトロジェン社） 、14 ngのmL ^-1のグルカゴン（ベッドフォード研究所）、7.5μgのmL ^-1のヒドロコルチゾン（ファルマシア）、100 U mL ^-1のペニシリン、および100μg/mlのmL ^-1のストレプトマイシン（Invitrogen社）。
2. 灌流チャンバ内のrecellularized肝臓移植片を配置し、ポンプは、気泡の形成を避けるために、5 mL / minの時に実行中に門脈カニューレを介して灌流システムにDLMを接続する。
3. 無菌的に灌流チャンバーを閉じて、培養中に任意の漏洩を避けるために、しっかりと密封する。
4. ^37℃であり、10％のCOを持っているインキュベーターに灌流システムを転送する_2〜15 mL / minに灌流流量を増加させる。
5. 95％O ₂および5％CO ₂混合ガスのタンクに人工肺を接続し、ガス流量0.5リットル/分に設定します。これは、近似の酸素分圧を達成する必要がありますtely 400 mmHgの。
6. 文化は、培地の日変化と10日前まで続けることができます。培地は、アルブミン、尿素および総胆汁酸の分泌のような移植片の肝機能のモニタリングのために毎日サンプリングされることがあります。培養期間の終了時に、recellularizedの肝臓移植は、分子と組織学的分析のためにサンプリングされることがあります。

4。代表的な結果：

ラットの肝臓の完全な細胞化は、記述されたプロトコルを使用して約72時間かかります。結果の行列は、繊維状のコラーゲンの100％、グリコサミノグリカンの50％、ネイティブの肝臓（ 表^1）6のDNAのわずか5％を保持。行列の血管構造は電子顕微鏡の解析（図^4）6をキャストしてスキャンするように腐食によって明らかに保持されます。 DLM内の血管のマイクロアーキテクチャーの存在は96％の効率とin vitro培養のためのその後の血流と細胞との再投入を容易にします。 recellularized肝移植は、in vitroで 10日間まで培養し、のようなアルブミン、尿素および総胆汁酸の分泌（図^5）6を介して確認された適切な肝臓機能を表示することができます。

図1。細胞化の過程の最後に脱細胞の肝臓の行列。切除後の（A）全体の肝臓は、（b）の中葉。

図2 DLMのrecellularizationの模式図。

図3。recellularizedの肝移植のin vitro培養用灌流システムのセットアップ。

図4微小血管の構造は、脱細胞の肝臓のマトリックスに保持されます。 ）正常な肝臓は、b）脱細胞の肝臓、ポータル（赤）と静脈（青）血管系の腐食キャストのイメージ。 DLMの電子顕微鏡像胆管のような細い血管（矢印）、スケールバー（A、B）5ミリメートル（C、D）20μmをフィーチャリングC）容器、d）のセクションをスキャン。

図5肝in vitroでの灌流培養中recellularized肝移植の特定の機能。 ）アルブミン分泌した（p = 0.5249）、B）尿素製造した（p = 0.5271）およびc）の総胆汁酸の分泌した（p = 0.0114）。実験と対照との差の統計的分析は、= 0.01でフリードマン検定により10日間の培養期間にわたって行われた。エラーバーは標準誤差（n = 3の）を表します。

	新鮮なlivera	脱細胞肝行列	p値	新鮮な肝臓の％
	n = 4の	N = 8
コラーゲン	0.07 ± 0.01	0.08 ± 0.03	0.56	114パーセント
（gの肝臓あたりのミリグラム）
グリコサミノグリカン	73.1 ± 6.7	34.2 ± 2.9	0.004	47パーセント
（gの肝臓あたりのミリグラム）
DNA	14.9 ± 5.6	0.44 ± 0.08	3.3 10 -5	2.9パーセント
（gの肝臓あたりのミリグラム）

表1。脱細胞の肝臓のマトリックスの生化学的組成は、ネイティブの肝臓と比較して。
値は平均± SEMとして表されます。

Discussion

ここで説明灌流細胞化法は、同一の全体構造とネイティブの肝臓の血管のマイクロアーキテクチャを持っている全体の肝臓足場を生成します。足場は、ネイティブの肝臓と同様の細胞外マトリックスの組成を有する。 recellularizationの方法は、試験のin vitro培養期間中に実行可能と機能性を維持高効率と細胞での細胞と足場の再投入を実現しています。 recellularizedの肝臓の移植への非実質細胞の追加により、我々はrecellularized肝移植は、薬物の代謝、再生と開発などの様々な肝臓の機能を研究するためのプラットフォームとして使用される場合があることを思い描く。それが潜在的に移植片⁶の血管構造の存在にレシピエント動物の感謝の血液循環への接続を介して移植することができるので、さらに、recellularizedの移植は、臨床応用を見つけることができます。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149