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Summary
Decelularização perfusão é uma nova técnica para produzir scaffolds fígado inteiro que mantém a composição do órgão matriz extracelular e microarquitetura. Aqui, o método de preparação de andaimes órgão inteiro usando decelularização perfusão e repovoamento posterior com hepatócitos é descrito. Enxertos de fígado para transplante funcional e pode ser gerado usando esta técnica.
Abstract
O fígado é um órgão complexo que requer constante de perfusão para a entrega de nutrientes e oxigênio e remoção de resíduos, a fim de sobreviver 1. Esforços para recriar ou imitar a microestrutura fígado com motivos de abordagem utilizando a engenharia de tecidos e técnicas de microfabricação não tenham sido bem sucedida até agora devido a este desafio do projeto. Além disso, biomateriais sintéticos usados para criar andaimes para aplicações de engenharia de tecidos do fígado têm sido limitados em induzir a regeneração dos tecidos e reparação, em grande parte devido à falta de motivos de células específicas de ligação que induziria as funções das células adequada 2. Tecidos decelularizados nativa vasos sanguíneos, tais 3 e 4 de pele, por outro lado têm encontrado muitas aplicações na engenharia de tecidos, e forneceram uma solução prática para alguns dos desafios. A vantagem de decelularizado matriz nativa é que ele mantém, até certo ponto, a composição original, a microestrutura e, conseqüentemente aumentando adesão celular ea reorganização 5.
Neste trabalho, descrever os métodos para realizar a perfusão decelularização do fígado, de tal forma que um fígado intacto bioscaffold que mantém a estrutura dos principais vasos sanguíneos é obtido. Além disso, descrevemos métodos para recellularize esses bioscaffolds com adultos hepatócitos primários, a criação de um enxerto de fígado que é funcional in vitro, e tem o acesso dos navios necessários para o transplante em vivo.
Protocol
1. Decelularização fígado
- Colheita de um fígado de ratos com canulação da veia porta utilizando e 18 de calibre do cateter. Deixe o inferior e veia cava superior aberta. Manter o órgão hidratado em tampão fosfato salino (PBS) numa placa de Petri de 10 cm.
- Criação de um sistema de perfusão, que consiste em reservatório de 8 litros, bomba peristáltica e um borbulhador.
- Preencher o sistema de perfusão com tampão fosfato e mantê-lo funcionando por 10 minutos. Preencha PBS em uma placa de Petri de 10 cm e reduzir a taxa de fluxo de tampão fosfato salino a 1 mL / min.
- Transferir cuidadosamente o fígado colhidas ao tampão fosfato salina preenchidos de 10 cm placa de Petri.
- Continue com perfusão PBS durante a noite.
- Iniciar a perfusão com 0,01% (w / v) dodecil sulfato de sódio (SDS) em água destilada por 5 minutos.
- Perfundir com PBS por 1 hora.
- Repita os passos 1.6 e 1.7 mais três vezes o aumento do tempo de perfusão SDS para minutos 10, 15 e 20 em cada tempo.
- Continue a perfusão com 0,01% (w / v) SDS por 24 horas.
- Continue a perfusão com 0,1% (w / v) SDS por 24 horas.
- Perfundir com 0,2% (w / v) SDS por 3 horas.
- Perfundir com 0,5% (w / v) SDS por 3 horas.
- Perfundir com água destilada por 15 minutos.
- Perfundir com 1% (w / v) de Triton X-100 em água destilada por 30 minutos para remover qualquer ácidos nucléicos ligado.
- Para lavar o fígado decelularizado matriz (DLM), perfundir com PBS por 2 horas.
- Opcional: ressecar todos os lobos, exceto o lobo mediano.
- Armazenar o DLM numa placa de Petri limpa e selada embebido em PBS a 4 ° C até que esteja pronto para uso (Figura 1).
- Para esterilizar o DLM: 1) Lave o DLM com PBS estéril contendo 0,1% (v / v) de ácido peracético e 4% (v / v) de etanol e incubar durante 3 horas a 4 o C. 2) Lavar com PBS esterilizado duas vezes. 3) Lavar com PBS estéril contendo 2% de penicilina-estreptomicina, 10ug / mL de gentamicina e 2,5 ug / ml anfotericina B. loja o fígado decelularizado na mesma solução a 4 ° C até ser utilizado para experimentos recellularization.
2. Recellularization de decelularizados Fígado Matrix
- Criação de um sistema de perfusão, que consiste de uma câmara de perfusão, bomba peristáltica e um borbulhador em condições estéreis. Preencher o sistema de perfusão com 200 mL de meio de cultura, por exemplo, alta de glicose DMEM (Sigma), 10% soro fetal bovino (Hyclone), 100 U mL -1 de penicilina e 100 mg mL -1 de estreptomicina (Invitrogen).
- Coloque a matriz fígado decelularizado na câmara de perfusão e conectar o DLM ao sistema de perfusão através da cânula da veia porta, enquanto a bomba está funcionando em 5 mL / min para evitar a formação de bolhas de ar.
- Permitir a perfusão do meio através da DLM por 30 minutos.
- Isolar hepatócitos primários de um rato adulto com viabilidade, pelo menos, 90%.
- Interromper o fluxo no sistema de perfusão e injecte lentamente 50000000 hepatócitos (em mL 1-3 de meio de cultura) em sistema de perfusão através do borbulhador.
- Iniciar o fluxo de 10 mL / min e recircular o meio por 10 minutos.
- Repita os passos 2.5 e 2.6, até um total de 200 milhões de células são introduzidas no DLM (Figura 2) 6.
- Uma vez que todas as células são perfundidos para a DLM, coletar o perfusato em quatro tubos de 50 ml de centrífuga e centrifugar a 600 rpm por 10 minutos. Descartar o sobrenadante e recolher as bolinhas em um único tubo. Determinar o número de células e viabilidade através de exclusão do azul tripan para determinar a eficiência da semeadura.
3. Cultivo in vitro do Enxerto Fígado Recellularized
- Criação de um sistema de perfusão, que consiste de uma câmara de perfusão, bomba peristáltica, oxigenador e um borbulhador em condições estéreis (Figura 3). Preencher o sistema de perfusão com 50 mL de meio de cultura, por exemplo, E Williams (Sigma), 5% soro fetal bovino (Hyclone), 0,5 mL de insulina U -1 (Eli Lilly), 20 ng mL -1 EGF (Invitrogen) , 14 ng mL -1 glucagon (Bedford Laboratories), 7,5 mg mL -1 hidrocortisona (Pharmacia), 100 U mL -1 de penicilina e estreptomicina 100 mg mL -1 (Invitrogen).
- Coloque o enxerto de fígado recellularized na câmara de perfusão e conectar o DLM ao sistema de perfusão através da cânula da veia porta, enquanto a bomba está funcionando em 5 mL / min para evitar a formação de bolhas de ar.
- Assepticamente fechar a câmara de perfusão e lacre firmemente para evitar qualquer vazamento durante a cultura.
- Transferir o sistema de perfusão de uma incubadora que é de 37 º C e tem 10% de CO 2 e aumentar a taxa de fluxo de perfusão a 15 mL / min.
- Conecte o oxigenador a um 95% O 2 e 5% CO 2 tanque de mistura de gás e definir a taxa de fluxo de gás para 0,5 litros / min. Isto deve atingir uma pressão parcial de oxigênio de aproximaçãotely mmHg 400.
- A cultura pode continuar até 10 dias, com variações diárias de meio de cultura. O meio de cultura podem ser amostrados diariamente para monitoramento das funções hepática do enxerto, tais como uréia, albumina e secreção de ácido total de bile. No final do período de cultura, o enxerto de fígado recellularized podem ser amostrados para análise molecular e histológica.
4. Resultados representativos:
A decelularização completa de um fígado de rato leva cerca de 72 horas usando o protocolo descrito. A matriz resultante mantém 100% do colágeno fibrilar, 50% dos glicosaminoglicanos e apenas 5% do DNA do fígado nativo (Tabela 1) 6. A estrutura vascular da matriz é preservada como evidenciado pela corrosão de fundição e digitalização análise de microscopia eletrônica (Figura 4) 6. A presença da microarquitetura vascular dentro da DLM facilita o seu repovoamento com células com uma eficiência de 96% e sua subseqüente perfusão de cultura in vitro. O enxerto de fígado recellularized podem ser cultivadas até 10 dias in vitro e exibe as funções do fígado adequada como foi confirmado através de uréia, albumina e secreção de bile ácida total (Figura 5) 6.
Figura 1. Decelularizados matriz de fígado no final do processo de decelularização. (A) todo o fígado (b) a mediana do lobo após a ressecção.
Figura 2. Representação esquemática do recellularization da DLM.
Figura 3. Perfusão configuração do sistema para a cultura in vitro do enxerto hepático recellularized.
Figura 4. A estrutura microvascular é retida na matriz do fígado descelularizados. Corrosão imagens elenco de a) b) um fígado decelularizado um fígado normal, portal (vermelho) e venosa vasculatura (azul). Digitalização de imagens de microscopia eletrônica do c DLM) um navio, d) apresentando uma seção do ducto biliar, como pequenos vasos (setas), barras de escala (a, b) 5 mm (c, d) 20 mM.
Figura 5. Liver funções específicas do enxerto hepático recellularized durante o cultivo in vitro de perfusão. uma secreção) de albumina (p = 0,5249), b) produção de uréia (p = 0,5271) e c) a secreção de bile ácida total (p = 0,0114). Análise estatística da diferença entre a experiência eo controle foi feito durante o período de 10 d cultura pelo teste de Friedman em a = 0,01. Barras de erro representam sem (n = 3).
| Livera fresco | Decelularizado fígado uma matriz | p-valores | % De fígado fresco | |
| n = 4 | n = 8 | |||
| Colágeno | 0,07 ± 0,01 | 0,08 ± 0,03 | 0,56 | 114% |
| (Mg por fígado g) | ||||
| Glicosaminoglicanos | 73,1 ± 6,7 | 34,2 ± 2,9 | 0,004 | 47% |
| (Mg por fígado g) | ||||
| DNA | 14,9 ± 5,6 | 0,44 ± 0,08 | 3.3 10 -5 | 2,9% |
| (Mg por fígado g) |
Tabela 1. A composição bioquímica da matriz fígado decelularizado em comparação com o fígado nativo.
uma Os valores são representados como média ± epm
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Discussion
O método descrito aqui decelularização perfusão produz um todo fígado andaime que tem a mesma estrutura bruta ea microarquitetura vascular do fígado nativo. O andaime tem uma composição da matriz extracelular semelhante ao fígado nativo. O método recellularization atinge repovoamento do andaime com células de alta eficiência e as células permanecem viáveis e funcionais durante o período de cultivo in vitro testados. Com a adição de células não parenquimatosos para o enxerto de fígado recellularized, prevemos que o enxerto de fígado recellularized pode ser usado como uma plataforma para estudar as funções do fígado diversos, tais como o metabolismo de drogas, a regeneração e desenvolvimento. Além disso, o enxerto recellularized pode encontrar a aplicação clínica, uma vez que pode potencialmente ser transplantado através de conexão com a circulação do sangue de um animal para destinatário graças a presença da estrutura vascular do enxerto 6.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer a Jack Milwid para o desenho da câmara de perfusão in vitro. Este trabalho foi financiado por concessões do NIH dos EUA, R01DK59766 e R01DK084053 para MY, R00DK080942 para KU, EUA NSF CBET-0853569 para KU e os Hospitais Shriners para Crianças, a BEU (concessão não. 8503). Reconhecemos também o apoio e os Hospitais Shriners para Crianças.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L4390 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Masterflex L/S Digital Drive | Cole-Parmer | EW-07523-80 | |
| Masterflex L/S Standard pump head | Cole-Parmer | EW- 07013-81 | |
| Bubble trap | Radnoti Glass Technology Inc. | 130149 |
References
- Kulig, K. M., Vacanti, J. P.
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation. Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).
- Schechner, J. S. Engraftment of a vascularized human skin equivalent. FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).
- Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S.
- Uygun, B. E. Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix. Nat Med. , (2010).
Tags
Emissão de bioengenharia 48 a matriz extracelular do fígado decelularização recellularization hepatócitos biorreatorErratum
Formal Correction: Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers
Posted by JoVE Editors on 03/14/2011.
Citeable Link.
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Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.
