Decellularization och Recellularization av Whole Lever

Summary

Perfusion decellularization är en ny teknik för att producera hela levern ställningar som behåller orgelns extracellulära matrix sammansättning och mikroarkitektur. Häri är metoden att förbereda hela orgeln ställningar med hjälp av perfusion decellularization och efterföljande återplantering med hepatocyter beskrivs. Funktionell och transplanterbara lever transplantat kan genereras med hjälp av denna teknik.

Abstract

Levern är ett komplext organ som ständigt perfusion för leverans av näringsämnen och syre och bortforsling av avfall för att överleva ^1. Arbetet med att återskapa eller efterlikna levern mikrostrukturen med anledning up-strategi med hjälp av vävnadsteknik och tekniker mikrofabrikation har inte varit framgångsrika hittills på grund av denna design utmaning. Dessutom har syntetiska biomaterial som används för att skapa ställningar för teknik levervävnad applikationer varit begränsad i förmå vävnadsregenerering och reparation till stor del på grund av brist på specifik cell bindning motiv som skulle förmå rätt cellfunktioner ^2. Decellularized infödda vävnader såsom blodkärl ³ och hud ⁴ å andra sidan har funnit många tillämpningar inom tissue engineering, och har gett en praktisk lösning till några av utmaningarna. Fördelen med decellularized infödda matrisen är att det behåller, i en omfattning, den ursprungliga sammansättning och mikrostruktur, därmed öka cellbindning och omorganisation ^5.

I detta arbete beskriver vi metoder för att utföra perfusion-decellularization i levern, så att en intakt lever bioscaffold som behåller strukturen av större blodkärl erhålls. Vidare beskriver vi metoder för att recellularize dessa bioscaffolds med vuxna primära hepatocyter, vilket skapar en lever transplantat som är funktionell in vitro, och har fartyget tillgång krävs för transplantation in vivo.

Protocol

1. Lever Decellularization

1. Harvest en råtta lever med portalen ven kanylering hjälp och 18-gauge kateter. Lämna lägre och högre hålvenen öppna. Håll orgeln hydratiserade i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en 10-cm petriskål.
2. Inrätta en genomblödning system som består av 8-liters behållare, peristaltiska pump och en bubbla fälla.
3. Fyll perfusionen systemet med fosfatbuffrad koksaltlösning och hålla den igång i 10 minuter. Fyll PBS i en 10-cm petriskål och minska flödet av fosfat saltlösning till 1 ml / min.
4. Försiktigt överföra skördade levern till fosfatbuffrad saltlösning fyllda 10-cm petriskål.
5. Fortsätt med PBS perfusion över natten.
6. Starta perfusion med 0,01% (w / v) natriumdodecylsulfat (SDS) i destillerat vatten i 5 minuter.
7. BEGJUTA med PBS i 1 timme.
8. Upprepa steg 1,6 och 1,7 tre gånger ökad SDS perfusionen tid till 10, 15 och 20 minuter vid varje gång.
9. Fortsätt perfusion med 0,01% (w / v) SDS i 24 timmar.
10. Fortsätt perfusion med 0,1% (w / v) SDS i 24 timmar.
11. BEGJUTA med 0,2% (w / v) SDS i 3 timmar.
12. BEGJUTA med 0,5% (w / v) SDS i 3 timmar.
13. BEGJUTA med destillerat vatten i 15 minuter.
14. BEGJUTA med 1% (w / v) Triton X-100 i destillerat vatten i 30 minuter för att avlägsna bundna nukleinsyror.
15. Att tvätta decellularized levern matris (DLM), BEGJUTA med PBS i 2 timmar.
16. Tillval: Resect alla lober utom medianen lob.
17. Förvara DLM i en ren och förseglas petriskål indränkt i PBS vid 4 ^° C tills den ska användas (figur 1).
18. Att sterilisera DLM: 1) Spola DLM med steril PBS innehållande 0,1% (v / v) perättiksyra och 4% (v / v) etanol och inkubera i 3 timmar vid 4 ^° C. 2) Tvätta med steril PBS 2 gånger. 3) Tvätta med steril PBS innehållande 2% penicillin-streptomycin, 10ug / mL gentamicin och 2,5 mg / ml amfotericin B. Förvara decellularized lever i samma lösning vid 4 ^° C tills den ska användas för recellularization experiment.

2. Recellularization av Decellularized Lever Matrix

1. Inrätta en genomblödning system som består av en genomblödning kammare, peristaltiska pump och en bubbelfälla under sterila förhållanden. Fyll perfusionen systemet med 200 ml odlingsmedium, t.ex. höga glukos DMEM (Sigma), 10% fetalt bovint serum (Hyclone,), 100 U mL ^-1 penicillin, och 100 mikrogram ml ^-1 streptomycin (Invitrogen).
2. Placera decellularized levern matrisen i perfusion kammare och anslut DLM till perfusion systemet via portalen ven kanylen medan pumpen går med 5 ml / min för att undvika bildandet av luftbubblor.
3. Låt perfusion av mediet genom DLM i 30 minuter.
4. Isolera primära hepatocyter från en vuxen råtta med minst 90% livskraft.
5. Stoppa flödet i perfusion systemet och injicera långsamt 50 miljoner hepatocyter (i 1-3 ml odlingsmedium) i perfusionen systemet genom bubbelfällan.
6. Starta flödet vid 10 ml / min och återcirkulera mediet i 10 minuter.
7. Upprepa steg 2,5 och 2,6 till totalt 200 miljoner celler förs in i DLM (Figur 2) ^6.
8. När alla celler är perfusion i DLM, samla perfusatet i fyra 50 ml centrifugrör och centrifugera vid 600 rpm i 10 minuter. Kasta supernatanterna och samla pellets i en enda rör. Bestäm antalet celler och livskraft genom trypan blå uteslutande för att bestämma sådd effektivitet.

3. In vitro kultur i Recellularized Lever Graft

1. Inrätta en genomblödning system som består av en genomblödning kammare, peristaltiska pumpar, oxygenator och en bubbelfälla under sterila förhållanden (Figur 3). Fyll perfusionen systemet med 50 ml odlingsmedium, t.ex. Williams E (Sigma), 5% fetalt bovint serum (Hyclone,), 0,5 U mL ^-1 insulin (Eli Lilly), 20 ng mL ^-1 EGF (Invitrogen) , 14 ng mL ^-1 glukagon (Bedford Laboratories), 7,5 mikrogram mL ^-1 hydrokortison (Pharmacia), 100 U mL ^-1 penicillin, och 100 mikrogram ml ^-1 streptomycin (Invitrogen).
2. Placera recellularized levern transplantat i perfusion kammare och anslut DLM till perfusion systemet via portalen ven kanylen medan pumpen går med 5 ml / min för att undvika bildandet av luftbubblor.
3. Aseptiskt stänga perfusion kammaren och sluter tätt för att undvika läckage under kultur.
4. Överför perfusionen systemet till en inkubator som är 37 ^° C och har 10% CO ₂ och öka graden perfusionen flödet till 15 ml / min.
5. Anslut oxygenator till en 95% O ₂ och 5% CO ₂ gasblandning tank och fastställa skattesatsen gasflödet till 0,5 liter / min. Detta bör få en syrets partialtryck om cirkately 400 mmHg.
6. Kulturen kan fortsätta upp till 10 dagar med dagliga förändringar av kultur medium. Den odlingsmedium kan provtas dagligen för övervakning av leverns funktion av transplantat, såsom albumin, urea och totalt galla syrasekretionen. I slutet av kulturen period får recellularized levern transplantat provtas för molekylär och histologisk analys.

4. Representativa resultat:

Den kompletta decellularization en råttlever tar ca 72 timmar med hjälp av den beskrivna protokollet. Den resulterande matrisen behåller 100% av fibrillar kollagen, 50% av glukosaminoglykaner och endast 5% av DNA av den infödda levern (tabell 1) ^6. Den vaskulära struktur i matrisen är bevarade, vilket framgår av korrosion gjutning och svepelektronmikroskopi analys (Figur 4) ^6. Förekomst av vaskulära mikroarkitektur inom DLM underlättar återplantering med celler med en verkningsgrad på 96% och den efterföljande perfusion för in vitro-kultur. Den recellularized levern transplantat kan odlas upp till 10 dagar in vitro och visar korrekt levern fungerar som bekräftas via albumin, urea och totalt gallsyror sekretion (Figur 5) ^6.

Figur 1. Decellularized levern matris i slutet av decellularization processen. (A) hela levern (b) median lob efter resektion.

Figur 2. Schematisk representation av recellularization av DLM.

Figur 3. Perfusion systeminställningarna för in vitro-kultur recellularized levern transplantat.

Figur 4. Mikrovaskulära strukturen är kvar i decellularized levern matrisen. Korrosion gjutna bilder av a) en normal lever b) en decellularized lever, portal (röd) och venösa (blå) kärlbädden. Svepelektronmikroskopi bilder av DLM c) ett fartyg, d) ett avsnitt med gallgången-liknande små fartyg (pilar), barer Scale (a, b) 5 mm (c, d) 20 ìm.

Figur 5. Lever specifika funktioner recellularized levern transplantat vid in vitro-perfusion kultur. a) albumin utsöndringen (p = 0,5249), b) urea produktion (p = 0,5271) och c) totalt galla syrasekretion (p = 0,0114). Statistisk analys av skillnaden mellan experiment och kontroll gjordes över 10 d kulturen perioden med Friedmans test vid a = 0,01. Felstaplar representerar SEM (n = 3).

	Färska livera	Decellularized lever matris en	p-värden	% Av färsk lever
	n = 4	n = 8
Kollagen	0,07 ± 0,01	0,08 ± 0,03	0,56	114%
(Mg per g lever)
Glykosaminoglykaner	73,1 ± 6,7	34,2 ± 2,9	0,004	47%
(Mg per g lever)
DNA	14,9 ± 5,6	0,44 ± 0,08	3.3 10 -5	2,9%
(Mg per g lever)

Tabell 1. Biokemiska sammansättning decellularized levern matris jämfört med infödda levern.
^en värden representeras som medelvärde ± SEM

Discussion

Den perfusion decellularization metod som beskrivs här ger en hel lever klätterställning som har samma grova struktur och det vaskulära mikroarkitektur av de infödda levern. Ställningen har en extracellulärmatrix sammansättning liknar infödda levern. Den recellularization metoden uppnår återplantering av ställningen med celler med hög effektivitet och cellerna förblir livskraftiga och fungerande under in vitro-testade kultur period. Med tillägg av nonparenchymal celler i recellularized levern transplantat föreställer vi oss att recellularized levern transplantat kan användas som en plattform för att studera olika levern funktioner såsom läkemedelsmetabolism, förnyelse och utveckling. Dessutom kan recellularized transplantat hitta klinisk tillämpning, eftersom den kan potentiellt vara transplanteras genom anslutning till blodcirkulationen i ett tack mottagardjur till förekomsten av vaskulära struktur i transplantat ^6.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium dodecyl sulfate	Sigma-Aldrich	L4390
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Masterflex L/S Digital Drive	Cole-Parmer	EW-07523-80
Masterflex L/S Standard pump head	Cole-Parmer	EW- 07013-81
Bubble trap	Radnoti Glass Technology Inc.	130149