Summary
Het introduceren van een gen van interesse in een cel is een krachtige methode voor het ophelderen van de functie in vivo. Dit protocol beschrijft een efficiënte methode voor het transfecteren een cultuur van menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs) met de Nucleofector elektroporatie apparaat gemaakt door Amaxa.
Abstract
Transfectie van primaire zoogdieren neurale cellen, zoals menselijke neurale stamcellen / precursor cellen (hNSPCs), met veel gebruikte kationische lipiden transfectiereagentia heeft vaak geleid tot een slechte levensvatbaarheid van de cellen en de lage transfectie-efficiëntie. Andere mechanische methoden van de invoering van een gen van belang, zoals een gen geweer of micro-injectie, worden ook beperkt door een slechte levensvatbaarheid van de cellen en de lage aantallen van getransfecteerde cellen. De strategie van het gebruik van virale constructen om een exogene gen te introduceren in primaire cellen is beperkt door zowel de hoeveelheid tijd en werk nodig is om virale vectoren en mogelijke veiligheidsproblemen te creëren. We beschrijven hier een stap-voor-stap protocol voor het gebruik van transfecteren hNSPCs Nucleofector apparaat Amaxa en technologie met elektrische stroom parameters en buffer-oplossingen die specifiek geoptimaliseerd voor het transfecteren neurale stamcellen. Met behulp van dit protocol hebben we bereikt de eerste transfectie efficiëntie van ~ 35% en ~ 70% na stabiele transfectie. Het protocol houdt een combinatie van een groot aantal hNSPCs met de DNA getransfecteerd worden in de juiste buffer, gevolgd door elektroporatie met de Nucleofector apparaat.
Protocol
Opmerking: Raadpleeg de passage menselijke neurale stamcellen artikel ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) en de Counting menselijke neurale stamcellen artikel ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) om te leren hoe te mengen en te tellen hNSPCs.
Voorbereiding
- Zorg ervoor dat er voldoende cellen beschikbaar zijn voor transfectie (enkele miljoenen cellen voor elk DNA getransfecteerd worden).
- Coat een weefselkweek schotel, waarin de getransfecteerde cellen worden gezaaid met 10 ug / ml humaan fibronectine de avond tevoren transfectie. Vlak voor het begin van de transfectie-protocol, verwijder de fibronectine, spoel de schotel met PBS, en plaats de cultuur media in de schotel. Laat de schotel in de 37 ° C weefselkweek incubator aan de media warm. Ook, plaats 1 ml van de cultuur media in de incubator te pre-warm tot 37 ° C.
- Plaats het DNA (s) te worden getransfecteerd, en transfectie (uit Amaxa), op ijs.
Transfectie
- Was een bepaald aantal cellen met PBS (we meestal gebruik ~ 5 x 106 cellen per transfectie). Pellet de cellen door centrifugeren (1000 toeren per minuut (~ 200xg) gedurende 5 minuten), verwijder zo veel PBS als mogelijk, en resuspendeer de cel pellet in 100 ui van de transfectie-oplossing die bij de transfectie kit. Breng de celsuspensie naar een 1,7 ml Eppendorf buis.
- Voeg 5 pi van het DNA (~ 50-10 ug van DNA per transfectie) om de celsuspensie en meng voorzichtig.
- Met behulp van de Amaxa mini-pipet de cel-DNA mix in de Amaxa transfectie cuvette. Zorg ervoor dat je 1 ml van de voorverwarmde kweekmedia voor de volgende stap. Ook, verwijder de cel gerecht met de cultuur media uit de incubator en plaats deze in de weefselkweek kap.
- Plaats de cuvette in de Nucleofector, draai het wiel met de klok mee, en selecteer het programma "A-033". Druk op Enter.
- Een succesvolle transfectie wordt aangegeven door de aanwezigheid van een zeer dichte laag van bellen op de top van de oplossing in de cuvet. Voeg 500 ul warm media in de cuvet, en het gebruik van de Amaxa mini-pipet de getransfecteerde cellen in de schaal met voorverwarmd media. Spoel de cuvet met meer warm media en voeg de spoel aan dezelfde schotel. Zet de schaal met cellen in het 37 ° C weefselkweek incubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol beschrijft een relatief snelle en efficiënte procedure voor transfectie hNSPCs. Met behulp van deze procedure, hebben wij de eerste transfectie efficiëntie van ~ 35%. Cellen die zijn getransfecteerd door deze procedure kan worden gebruikt voor korte-termijn studies (transient getransfecteerde cellen) of voor een langere-termijn studies als een selectiemiddel wordt gebruikt om een stabiel getransfecteerde bevolking te genereren. We hebben gegenereerd stabiel getransfecteerde cellen waarin ~ 70% van de cellen drukken de exogene eiwit. In transient getransfecteerde hNSPCs, hebben we geconstateerd voortgezet expressie van het exogeen eiwit voor ~ 7 dagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
De auteurs willen dr. Philip H. Schwartz van de National Human Resource Neural Stamcel erkennen bij de Children's Hospital, Orange County Instituut voor het verstrekken van hNSPC culturen.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
