Summary
Здесь показано, протокол проводить окрашивание живой элемент, который может быть использован для обнаружения одоранта рецепторами на поверхности клетки HEK293T удобно. Кроме того, она также может быть использована для анализа на поверхности экспрессию других хемосенсорных рецепторов или GPCRs.
Abstract
Яркий мир запахов признается чувство обоняния. Обоняние у мышей опосредованы репертуаре около 1200 G белком рецепторы (GPCR) 1, которые постулируются для связывания летучих молекул одоранта и преобразования внеклеточного сигнала в внутриклеточного сигнала связи с G белком Gαolf. Связывание одорантов на рецепторы, как полагают, следовать комбинаторной правило, то есть тот, одоранта может связывать несколько рецепторов и одного рецептора может связывать несколько отдушки и в разной степени 2. Биохимические, сигнализации и связывание лигандов исследований было удобно проводить для большинства GPCRs использовании гетерологичной клеток. Однако использование гетерологичной клеток для изучения рецепторов одоранта, была исключена в течение длительного времени, так как на трансфекции им не удалось экспортировать на поверхность. Сайто и др. показали, одного рецептора мембраны проходят Транспортировка белка (RTP) семья сопровождающих шоу повышенной экспрессии в обонятельной сенсорных нейронов и выступают в качестве сопровождающих для движения одоранта рецепторами на поверхности клетки в гетерологичных, когда совместно трансфицированных вместе 3. Для проведения биохимических анализов для рецепторов использовании гетерологичной клетки, нужно сначала определить, если рецептор показывает надежную выражение поверхности клеточной линии. Это может быть проанализированы по гиперэкспрессией рецепторов с сопровождающим RTP1S последующим окрашиванием живой клетки к флуоресцентно этикетке внеклеточного домена или тег в внеклеточный домен исключительно. Здесь показано, протокол проводить окрашивание живой элемент, который может быть использован для обнаружения одоранта рецепторами на поверхности клетки HEK293T удобно. Кроме того, она также может быть использована для анализа на поверхности экспрессию других хемосенсорных рецепторов или GPCRs.
Protocol
1. Порядок действий:
Процедура состоит из трех частей завершила более общее время 3-х дней: передача клеток, трансфекции и иммуноцитохимия, один шаг осуществляется в день. Передача и трансфекции клеток в течение первых двух дней должна проводиться в стерильных условиях в камере ламинарного потока.
День 1: Передача HEK293T клетки для поверхностного анализа выражения.
- Передача среды (М10): Смешайте минимальной необходимой среде с добавлением 10% (по объему) эмбриональной телячьей сыворотки в стерильных условиях.
- Расти клетки желаемого слияния в 100 мм пластины культуры, в зависимости от количества пластин, необходимых для настройки. Важно, чтобы определить долю клеток, должны быть переданы, чтобы избежать заросшие или редкие клетки: например, из 100% сливной 100 мм блюдо, одно может передать около 3% до 35 мм блюдо для получения около 30% слияния в последнего.
- До передачи клеток, в стерильной камере ламинарного потока, пальто 22 X 22 мм, стеклянная крышка скользит стерильным поли D лизина (1 мг / мл) и поместить по одному в каждой 35 мм блюдо культуры клеток, покрытых стороной вверх для гальванических ячеек (рис. 1 ). Разрешить решение высохнуть в течение 5 - 10 минут. В течение этого интервала, УФ источник в ламинарных палаты может быть включено для стерилизации крышка скользит, если это необходимо. Поли D лизин помогает гетерологичных клетки придерживаться крышка скользит.
- Для переноса клеток, аспирата из существующих средств массовой информации в 100мм блюдо, вымыть, тщательно добавления 8 мл стерильной PBS, PBS и аспирации trypsinize клетки в 3 мл 0,05% трипсина-EDTA, когда клетки отделяются от блюда, блокировать дальнейшее реакцию, добавив 5 мл M10. Измельченного в порошок клетки и передачу необходимых объемов для стерильных коническую трубку; центрифуге при 200g в течение 5 минут для осаждения клеток. Аспирацию из супернатант, содержащий Трипсин-EDTA, оставляя осадок клеток неповрежденной. Для передачи клетках до 35 блюд мм, добавьте 1 мл M10 для каждого блюда и растирают отделить клетки. Добавить 1 мл ресуспендировали клетки к каждому блюду. Инкубируйте клетки ночи при 37 ° C, 5% СО 2.
Рисунок 1. Coat 22 X 22 мм стекла покровные с поли D лизина и разместить один покрытием стороной вверх в каждой 35 мм блюдо.
День 2: Трансфекция HEK293T клеток.
- 18-24 часов после передачи, клетки готовы для трансфекции рецептор быть проанализированы. Используйте рецепторов и RTP1S клонированы в вектор экспрессии млекопитающих PCI, приготовленных из культур бактерий использованием Qiagen Miniprep Kit следующий протокол, описанный ранее 4. Используйте рецепторы, которые неизлечимо N помеченные 20 аминокислот долго родопсина эпитопа для облегчения иммунной окраски.
- Используйте 1000ng рецептора построить, 250 нг RTP1S построить и 50 нг зеленая флуоресценция белка каждой трансфекции. Выполните трансфекции с использованием Lipofectamine 2000 году, а в руководстве производителей.
День 3: Иммуноцитохимическая для визуализации клеточных рецепторов поверхность покрыта ржавчиной.
- Перед началом, подготовить окрашивания и моющих растворов и охладить их до 4 ° C. Окрашивание среды: минимально необходимый средний, 45 мл; фетальной телячьей сыворотки, 5 мл; HEPES (1M), 500 мкл (конечная концентрация 10 мМ), азида натрия (1,5), 500 мкл (конечная концентрация 15 мм). Промывочный раствор: HBSS, 500 мл; HEPES (1M), 5 мл (конечная концентрация 10 мМ), азида натрия (1,5), 5 мл (конечная концентрация 15 мм). Оба решения могут храниться при температуре 4 ° С для повторного использования. Подготовка антител решения путем разбавления требуется антител в окрашивании среду в 100 раз.
- Начало иммунохимии для поверхностного окрашивания рецепторов одоранта около 24 часа после трансфекции. Для выполнения жить окрашивания клетки, экспериментальной установки должен быть охлажден до 4 ° C: заполнить большой содержащихся со льдом и погладить поверхности льда, чтобы сделать его как можно ровнее, место лоток на льду и распылять его на 70% этанола. Отрежьте кусок парафильмом (меньше, чем длина лоток) и прикрепите его на этанол распыляется лоток, для получения гладкой поверхности. Передача стеклянная крышка скользит содержащие трансфекции клеток на парафильмом, по одному за раз, сотовые стороной вверх, с помощью пинцета. Слой каждого покровным стеклом с 100 мкл холодного первичного решение окраски, экструзии тщательно от угла скольжения (рис. 2). После всех слоев крышка скользит с антителами решение, крышка лотка для предотвращения высыхания раствора в воздухе. Провести первичную инкубации в течение 45-60 минут.
- После первичной инкубации, быстро передавать крышка скользит к первоначальному 35 блюд культуры, содержащие средства массовой информации. Аспирируйте медиа и добавьте 2 мл охлажденной промывочного раствора осторожно от края блюдо, чтобы предотвратить потерю клеток из покровным стеклом. Аспирируйте промывочного раствора и повторите дважды, чтобы выполнить три стирок. В конце третьего мытья, не аспирата из промывочного раствора.
- Подготовка вторичными антителами solutiна окрашивание в средствах массовой информации и передачи крышка ускользает из моющего раствора, чтобы вновь наносится слой парафильмом в том же лотке. Снова осторожно выдавите 100 мкл раствора антител к слою каждого покровным стеклом, из-за угла, как первичный инкубации. Провести вторичное инкубации в течение 30 - 45 минут и трансфер обратно в промывочный раствор в оригинальной 35 блюд мм. Еще раз, вымойте крышку проскальзывает в три раза, как описано.
- Аспирируйте промывочного раствора с прошлого вымыть и добавить 2 мл 1% охлажденной параформальдегида. Fix клеток в охлажденной 1% параформальдегида решение, на льду в течение 15 минут.
- Установите крышку надевает чистое стекло микроскопа слайды использованием реагента Mowiol монтажа, с клеткой стороной вниз и осторожно исключить все пузырьки воздуха (рис. 3). После Mowiol высыхает воздух, мыть крышку мягко скользит добавлением дистиллированной воды на поверхности и аспирационных немедленно.
Рисунок 2. Слой каждого покровное с 100 мкл холодного первичного решения окрашивания.
Рисунок 3. Гора покровные с клеткой стороной вниз на чистую предметные стекла микроскопа использованием Mowiol монтажа реагента.
2. Представитель Результаты:
Живая клетка окрашивания позволяет визуализировать белки на поверхности клеток, на трансфекции рецепторов с шаперонов (в данном случае рецепторов одоранта Olfr62 с рецептором Транспортировка RTP1S белка) (рис. 4). Сотовые поверхности окрашивания рецепторов характеризуется точечным рисунком окрашивания (рис. 4В, вставка). Окрашивание проводится неправильно может привести к увеличению шума, что делает его трудным для наблюдателя отличить реальные окрашивания поверхность от шума. 
Рисунок 4. Трансфекция рецепторов с шаперонов позволяет визуализации белков на поверхности клеток с использованием живых окрашивания клеток. Трансфекция одоранта рецептор Olfr62 в одиночку () и трансфекции Olfr62 с RTP1S шаперонов (B). Уровни GFP выражение служить трансфекции управления (А 'и Б').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Каждый шаг должен быть проведена тщательно, чтобы гарантировать известных и отличительные поверхности окрашивания. Весь процесс окрашивания должны выполняться в холодную (на льду), и подносом, на котором крышка скользит проложены должен быть охлажден до использования, чтобы обеспечить клетки остаться в живых. Более того фиксация происходит в конце процесса окрашивания поверхность. Это находится в резком контрасте с внутренней окрашивание, где фиксация предшествует окрашивания в permeabilize клеточной мембраны к начальному и среднему антител. Время экспозиции покрытия скользит в воздухе должно быть сведено к минимуму, чтобы предотвратить клетки от высыхания, поэтому слои покрытия скользит с антителами решений, передавая крышка скользит мыть решение, обмен промывочного раствора между моет должно быть сделано быстро и по одному за раз При работе с несколькими скользит крышку.
В зависимости от эпитопа теги и антител используется один, один, возможно, придется корректировать время инкубации, количество моет, и сложите антител разбавления. Фоновый шум можно избежать путем разбавления антител более или увеличения числа моет, или сокращение времени инкубации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Мы благодарим членов Мацунами лабораторию для критического чтения этой рукописи.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
