Summary
在这里，我们展示了一个协议，进行活细胞染色，可用于检测HEK293T细胞表面上的气味受体方便。此外，它也可能被用来检测其他化学感受受体或GPCRs的表面表达。
Abstract
是公认的嗅觉感的生动的气味世界。在小鼠的嗅觉是介导的由约1200克蛋白偶联受体（GPCRs）1，假设绑定挥发的气味分子，并通过与G蛋白耦合Gαolf的胞内信号转换成细胞外信号的剧目。绑定的气味受体被认为是按照组合规则，也就是说，一个气味可能几个受体绑定和一个受体可以绑定几个气味不同程度2。生化，信令和配体结合研究已方便进行最GPCRs的使用异种细胞。但是使用的气味受体的研究，异种细胞，排除了很长一段时间，因为他们在转没有出口到表面。 Saito等人已经证明单膜通过受体运输蛋白（RTP）的家庭伴侣显示在嗅感觉神经元和交通气味受体在异种细胞的表面，当联合一起转了3伴侣的行为表达增强。要利用异种细胞的受体进行生化检测，必须先确定，如果受体的细胞株显示了强大的表面表达。这可以检测高表达的受体与由活细胞染色，荧光标签或专门的外域外域标记的伴侣RTP1S。在这里，我们展示了一个协议，进行活细胞染色，可用于检测HEK293T细胞表面上的气味受体方便。此外，它也可能被用来检测其他化学感受受体或GPCRs的表面表达。
Protocol
1。程序：
该过程包括三个部分，超过3天的总时间完成：转移细胞，转染和免疫细胞化学，每天进行一个步骤。转移和细胞的转染前两天，必须在层流室的无菌条件下进行。
第1天：转让HEK293T细胞表面表达检测。
- 传输介质（M10）：混合辅以10％（体积比）牛血清胎儿在无菌条件下的最低限度的基本介质。
- 种植细胞所需的汇合在一个100mm的培养板，根据需要设置的板块数量。重要的是要确定避免杂草丛生或稀疏的细胞被转移到细胞的一小部分：例如，从100％的融合100毫米菜，一可转移约3％至35毫米的菜中获得约30％的汇合后者。
- 在此之前转移细胞，在无菌层流室，大衣22 x 22毫米玻璃与无菌ð聚赖氨酸（1毫克/毫升）和每35毫米的细胞培养皿中的地方，有涂层的一面电镀细胞盖玻片（图1 ）。允许干5 - 10分钟的解决方案。在此期间，可打开紫外光源在层流室，消毒盖玻片，如果需要的话。 ð聚赖氨酸有助于异种细胞粘到盖玻片。
- 转移细胞，吸出为100mm碟现有媒体，通过仔细加入8 mL无菌PBS，吸出PBS洗，用3毫升0.05％胰蛋白酶EDTA trypsinize的细胞，细胞分离从盘时，阻止进一步酶促反应加入5毫升的M10。磨碎的细胞和所需量转移到无菌的锥形管;在200克离心5分钟沉淀细胞。吸出上清液含有胰蛋白酶EDTA，使颗粒细胞完好无损。细胞转移至35 mm培养皿中，每道菜添加1毫升M10和磨碎游离的细胞。加入1毫升的悬浮细胞每一道菜。孵育细胞过夜，于37℃，5％的CO 2。
图1。大衣22 x 22毫米，与聚ð赖氨酸和地方每盘35毫米的有涂层的一面盖玻片。
第2天：转染HEK293T细胞。
- 18-24小时后，转移，细胞是准备要测定受体的转。使用受体在哺乳动物表达载体PCI编写使用Qiagen公司小量Kit中的下列协议前4描述的细菌培养，克隆RTP1S 。使用，是N末期与20个氨基酸长的视紫红质的抗原表位标记，以方便免疫受体。
- 使用受体的构建，250纳克RTP1S构建绿色荧光蛋白转和50毫微克1000ng。执行转用脂质体2000，为制造商手册。
第3天：免疫组化，可视化细胞表面染色受体。
- 在开始之前，准备染色和洗涤解决方案，并冷却至4 ° C染色介质：最低限度的基本中等，45毫升;胎牛血清，5毫升; HEPES（1M），500μL（终浓度为10毫米）;叠氮化钠（1.5M），500μL（终浓度为15毫米）。洗涤液：HBSS中，500毫升; HEPES（1M），5毫升（终浓度为10毫米）;叠氮化钠（1.5M），5毫升（终浓度为15MM）。这两种解决方案都可以存储在4 ° C重用。准备所需的抗体染色介质的100倍稀释的抗体解决方案。
- 开始表面约24小时后转染的气味受体免疫组织化学染色。要执行的活细胞染色，实验的设立，必须冷却至4 ° C时：填补了大型载冰和拍拍冰面，使其尽量均匀，放置一个托盘上的冰，并喷洒70％乙醇。剪下一块封口膜（小于托盘的长度），并加盖乙醇喷托盘上，以获得一个光滑的表面。传输的玻璃盖玻片含有转染细胞上的封口膜，一次一个，细胞一侧，用小镊子。层每个盖玻片用100μL冷主要染色液，挤压滑（图2）从一个角落仔细。分层抗体溶液与盖玻片后，包括托盘，以防止干燥空气中的解决方案。开展初级孵化45-60分钟。
- 初级孵化后，迅速转移到原来的35毫米培养皿盖玻片，包含媒体。吸媒体和添加2毫升冷冻洗涤液从盘边缘，轻轻地从细胞的盖玻片，以防止丢失。吸出洗涤液，重复两次完成三洗。第三洗结束，不吸洗涤液。
- 准备二次抗体soluti。在染色媒体和盖玻片从洗涤液转移到一个新贴的封口膜层在同一托盘。再次轻轻挤出100μL抗体溶液层像初级孵化的角落，每个盖玻片。二次孵化开展30 - 45分钟，并传回在原有的35毫米菜的洗涤液。再次，洗盖玻片三倍。
- 吸洗最后一次洗涤的解决方案，并添加2 mL 1％的冷冻多聚甲醛。修复细胞冷冻1％多聚甲醛溶液中，冰浴15分钟。
- 装入清洁显微镜的玻璃盖玻片幻灯片使用安装试剂Mowiol，与细胞的一侧，谨慎地排除所有气泡（图3）。一旦Mowiol晾干，轻轻洗盖玻片表面上加入蒸馏水，立即吸。
图2层每个盖玻片，用100μL冷主染色液。
图3安装与细胞方面的盖玻片上干净的玻璃显微镜下来幻灯片使用Mowiol安装试剂。
2。代表性的成果：
活细胞染色使一个可视化的细胞表面的蛋白质，与伴侣（在此情况下气味受体Olfr62与受体的运输蛋白RTP1S）（图4）受体的转染。受体细胞表面染色的特点是点状染色格局（图4B，插图）。染色进行不适当，可能会导致更高的噪声，使观察者难以区分真正的表面染色从噪音。 
图4转染受体与伴侣允许使用活细胞染色的细胞表面蛋白质的可视化。转染Olfr62单独的嗅觉受体（A）和与RTP1S伴侣（二）转染的Olfr62。 GFP表达水平作为一个转控制（A'和B'）。
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Discussion
每一步都必须小心进行，以确保突出和独特的表面染色。整个染色过程中，必须在寒冷的开展（冰），和盖玻片奠定托盘必须被冷却之前使用，以确保细胞活路。此外，固定做表面染色过程结束。这是内部染色，其中固定先染色通透细胞膜的小学和中学抗体形成鲜明对比的。盖玻片暴露在空气中的时间必须最小化，以防止从干涸的细胞，因此盖玻片与抗体的解决方案的分层，转让盖玻片洗涤液，洗之间的清洗液交流必须做到快速和一个一次当处理多个盖玻片。
根据表面抗原标记和抗体的人使用，可能需要调整的孵化时间，清洗数量，和抗体稀释倍。稀释的抗体或增加清洗，或缩短培养时间，可避免背景噪音。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
我们感谢阅读这篇稿子的关键松波实验室的成员。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
