Summary
Hier laten we zien een protocol voor het uitvoeren van live cell vlekken die kunnen worden gebruikt om de geurstof receptoren gemakkelijk te detecteren op het oppervlak van HEK293T cellen. Daarnaast kan het ook worden gebruikt om de analyse voor oppervlakte-expressie van andere chemosensory receptoren of GPCR's.
Abstract
De levendige wereld van geuren is erkend door het gevoel van reukzin. Reukzin bij muizen wordt gemedieerd door een repertoire van ongeveer 1200 G-eiwit gekoppelde receptoren (GPCR's) 1, die verondersteld dat vluchtige odorant moleculen binden en het omzetten van de extracellulaire signaal om in een intracellulaire signaal door koppeling met G-eiwit Gαolf. Binding van de geurstoffen aan de receptoren wordt beschouwd als een combinatorische regel, dat is een geurstof, kan binden verschillende receptoren en een receptor kan verschillende geurstoffen te binden in verschillende mate 2 te volgen. Biochemische, signalering en ligand binding studies zijn geschikt uitgevoerd voor de meeste GPCR's met behulp van heterologe cellen. Maar van heterologe cellen gebruiken voor de studie van odorant receptoren, was uitgesloten voor een lange tijd geleden op transfectie ze niet exporteren naar de oppervlakte. Saito et al. hebben aangetoond dat een membraan passeren Receptor Transport Protein (RTP) familie begeleiders verhoogde expressie zien in de olfactorische sensorische neuronen en treden op als begeleiders om het verkeer odorant receptoren aan de oppervlakte in heterologe cellen, bij gelijktijdige samen getransfecteerd 3. Voor het uitvoeren van biochemische assays voor het gebruik van heterologe receptoren cellen, moet men eerst nagaan of de receptor vertoont robuuste oppervlakte-expressie in de cel lijn. Dit kan worden getest door overexpressie van de receptoren met de begeleider RTP1S, gevolgd door live-cell kleuring om fluorescent label het extracellulaire domein of een tag in het extracellulaire domein exclusief. Hier laten we zien een protocol voor het uitvoeren van live cell vlekken die kunnen worden gebruikt om de geurstof receptoren gemakkelijk te detecteren op het oppervlak van HEK293T cellen. Daarnaast kan het ook worden gebruikt om de analyse voor oppervlakte-expressie van andere chemosensory receptoren of GPCR's.
Protocol
1. Procedure:
De procedure bestaat uit drie delen uitgevoerd over een totale tijd van 3 dagen: de overdracht van cellen, transfectie en immunocytochemie, een stap uitgevoerd per dag. Overdracht en transfectie van cellen over de eerste twee dagen moet worden uitgevoerd in steriele omstandigheden in een laminaire stroming kamer.
Dag 1: Overdracht van HEK293T cellen voor oppervlakte-expressie test.
- Medium voor de overdracht (M10): Mix minimum essentieel medium aangevuld met 10% (in volume) foetaal runderserum in steriele toestand in.
- Grow cellen om een gewenste confluentie in een 100mm cultuur plaat, afhankelijk van het aantal platen nodig is in te stellen. Het is belangrijk om vast te stellen de fractie van de cellen worden overgebracht naar overwoekerd of schaarse cellen te voorkomen: bijvoorbeeld van een 100% confluent 100 mm schaal, kan men ongeveer 3% over te dragen aan een 35 mm schaal tot ongeveer 30% confluentie te verkrijgen in de laatste.
- Voorafgaand aan de overdracht van cellen, in de steriele laminaire stroming kamer, jas 22 X 22 mm glazen dekglaasjes met steriele poly D lysine (1 mg / ml) en plaats een in elke 35 mm cel cultuur schotel, gecoate zijde omhoog voor plating cellen (figuur 1 ). Laat de oplossing om te drogen voor 5 - 10 minuten. Tijdens dit interval kan de UV-bron in de laminaire kamer worden ingeschakeld om de dekglaasjes steriliseren, indien gewenst. Poly D lysine helpt heterologe cellen vasthouden aan de dekglaasjes.
- Voor de overdracht van cellen, zuigen uit de bestaande media in de 100mm schaal, was door zorgvuldig toe te voegen 8 ml steriel PBS, aspireren PBS en trypsinize de cellen met behulp van 3 ml 0,05% trypsine-EDTA; wanneer de cellen los van de schotel, verder enzymatische reactie te blokkeren door het toevoegen van 5 mL M10. Vermaal de cellen en de overdracht vereiste volume om een steriele conische buis; centrifuge bij 200 g gedurende 5 minuten om pellet de cellen. Aspireren uit supernatant met trypsine-EDTA, waardoor de pellet van de cellen intact. Voor de overdracht van de cellen tot 35 mm gerechten, voeg 1 mL M10 voor elk gerecht en vermaal om de cellen te scheiden. Voeg 1 ml van de geresuspendeerde cellen om elk gerecht. Incubeer cellen een nacht bij 37 ° C, 5% CO 2.
Figuur 1. Coat 22 X 22 mm glas dekglaasjes met poly D lysine en plaats een gecoate zijde in elke 35 mm schaal.
Dag 2: Transfectie van HEK293T cellen.
- 18-24 uur na de overdracht van de cellen zijn klaar voor transfectie van de receptor te worden getest. Gebruik receptor en RTP1S gekloneerd in zoogdieren expressievector PCI, bereid uit bacterieculturen gebruik van Qiagen Miniprep Kit volgende beschreven protocol vóór 4. Gebruik receptoren die terminaal N getagd met 20 aminozuren lang rhodopsine epitoop te immunokleuring te vergemakkelijken.
- Gebruik 1000ng van receptor construct, 250 ng van RTP1S bouwen en 50 ng van de groene fluorescentie eiwit elke transfectie. Voer transfectie met behulp van Lipofectamine 2000, als per fabrikanten handleiding.
Dag 3: immunocytochemie aan de celoppervlak-receptoren bevlekt te visualiseren.
- Voorafgaand aan het starten, voor te bereiden vlekken en wassen oplossingen en koel ze tot 4 ° C. Vlekken medium: Minimum Essential Medium, 45 ml; Fetal Bovine Serum, 5 ml; HEPES (1M), 500 pi (eindconcentratie 10mm); natriumazide (1.5M), 500 pi (eindconcentratie 15mm). Was de oplossing: HBSS, 500 ml; HEPES (1M), 5 ml (eindconcentratie 10mm); natriumazide (1.5M), 5 ml (eindconcentratie 15mm). Beide oplossingen kunnen worden opgeslagen bij 4 ° C voor hergebruik. Bereid door verdunning van antilichamen oplossingen vereist antilichamen in de kleuring medium 100-voudig.
- Start immunochemie voor oppervlakte kleuring voor geurstof receptoren ongeveer 24 uur na transfectie. Om levende cellen kleuring, de experimentele set-up moet worden gekoeld tot 4 ° C uit te voeren: vul een grote bevatte met ijs en dep het oppervlak van ijs om het te maken zo gelijk mogelijk, plaats een dienblad op het ijs en spuit het met 70% ethanol. Knip een stuk parafilm (kleiner dan de lengte van de lade) en plak deze op de ethanol gespoten lade, om een glad oppervlak te verkrijgen. Breng de glazen dekglaasjes met getransfecteerde cellen op de parafilm, een voor een, cel kant naar boven, met een pincet. Laag elk dekglas met 100 ul koude primaire kleuroplossing, extruderen voorzichtig vanuit een hoek van de slip (figuur 2). Nadat gelaagdheid van alle dekglaasjes met antilichaam oplossing, dek de bak om te voorkomen dat opdrogen van de oplossing in de lucht. Het uitvoeren van de primaire incubatie gedurende 45-60 minuten.
- Na de lagere incubatie, snel overbrengen dekglaasjes naar de originele 35mm cultuur gerechten, met de media. Aspireren de media en voorzichtig voeg 2 ml gekoeld wasoplossing van de rand van de schotel tegen het verlies van cellen van het dekglas. Aspireren de wasoplossing en herhaal twee tot drie wasbeurten te voltooien. Aan het eind van de derde wassen, niet zuigen de wasoplossing uit.
- Bereid secundair antilichaam solutiop in de kleuring media en breng de dekglaasjes van de was-oplossing naar een nieuw aangebracht parafilm laag in dezelfde lade. Weer voorzichtig extruderen 100 pi van antilichamen oplossing voor elke laag dekglas, vanaf de hoek, zoals de primaire incubatie. Het uitvoeren van secundaire incubatie gedurende 30 - 45 minuten en transfer terug naar de wasoplossing in de originele 35 mm gerechten. Eens te meer, was de dekglaasjes drie keer zo beschreven.
- Aspireren wasoplossing van de laatste wasbeurt en voeg 2 ml 1% gekoeld paraformaldehyde. Fix cellen in gekoelde 1% paraformaldehyde oplossing, op ijs gedurende 15 minuten.
- Monteer de dekglaasjes op schone microscoop glasplaatjes met behulp van montage reagens Mowiol, met de cel naar beneden en voorzichtig sluiten alle luchtbellen (figuur 3). Zodra Mowiol lucht wordt gedroogd, voorzichtig te wassen dekglaasjes door toevoeging van gedistilleerd water op het oppervlak en aspireren onmiddellijk.
Figuur 2. Layer elk dekglaasje met 100 ul koude primaire kleuroplossing.
Figuur 3. De dekglaasjes beneden de berg met de cel kant op schoon glas microscoopglaasjes met behulp van Mowiol montage reagens.
2. Representatieve resultaten:
Levende cellen vlekken in staat stelt een aan eiwitten op het oppervlak van cellen te visualiseren, op transfectie van receptoren met chaperonnes (in dit geval geurstof receptor Olfr62, met Receptor vervoeren Protein RTP1S) (figuur 4). Celoppervlak kleuring van receptoren wordt gekenmerkt door punctata patroon van de vlekken (Figuur 4B, inzet). Vlekken uitgevoerd ongepaste kan leiden tot een hogere ruis, waardoor het moeilijk is voor de waarnemer naar de echte oppervlakte vlekken te onderscheiden van lawaai. 
Figuur 4. Transfectie van receptoren met chaperonnes zorgt voor de visualisatie van eiwitten op het oppervlak van cellen met behulp van live cell vlekken. Transfectie van de geurstof receptor Olfr62 alleen (A) en transfectie van Olfr62 met RTP1S chaperone (B). GFP expressie niveaus dienen als een transfectie controle (A 'en B').
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Elke stap moet worden uitgevoerd zorgvuldig te prominent en onderscheidend oppervlak vlekken zorgen. Het gehele kleuring proces moet worden uitgevoerd in koud (op ijs), en de lade waarop de dekglaasjes worden gelegd dient vooraf te worden gekoeld om te gebruiken om ervoor te zorgen cellen in leven te blijven. Bovendien fixatie wordt gedaan aan het eind van het oppervlak beitsen. Dit staat in schril contrast met de interne kleuren waar fixatie voorafgaat vlekken op de celmembraan permeabilize aan primaire en secundaire antilichamen. De tijd van de blootstelling van dekglaasjes de lucht moet worden geminimaliseerd om de cellen van opdrogen te voorkomen, daarom gelaagdheid van dekglaasjes met antilichaam-oplossingen, het overdragen dekglaasjes om de oplossing te wassen, moet uitwisseling van wasoplossing tussen de wasbeurten snel en een worden gedaan op een moment bij het hanteren van meerdere dekglaasjes.
Afhankelijk van de epitoop-tag en de antilichamen gebruikt men, kan een te incubatietijd, aantal wasbeurten, en plooi van antilichaamverdunning aan te passen. Achtergrondlawaai kan worden vermeden door verdunning van de antilichamen meer of verhogen van het aantal wasbeurten, of bakvet incubatietijd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Wij danken de leden van de Matsunami laboratorium voor kritische lezing van dit manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
