Summary
यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए बाहर रहते सेल धुंधला हो जाना है कि HEK293T कोशिकाओं की सतह पर odorant रिसेप्टर्स सुविधा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ले. इसके अलावा, यह भी अन्य chemosensory रिसेप्टर्स या GPCRs की सतह अभिव्यक्ति के लिए परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Abstract
odors में से ज्वलंत दुनिया olfaction की भावना के द्वारा मान्यता प्राप्त है. चूहों में olfaction के एक प्रदर्शनों की सूची के बारे में 1200 जी प्रोटीन युग्मित (GPCRs) रिसेप्टर्स 1 कि अस्थिर odorant अणुओं बाँध माने हैं और intracellular सिग्नल में जी प्रोटीन Gαolf के साथ युग्मन द्वारा कोशिकी संकेत में परिवर्तित द्वारा मध्यस्थता है. Odorants के रिसेप्टर्स के लिए बाध्य करने के लिए एक मिश्रित नियम है, कि, एक odorant कई रिसेप्टर्स बाँध सकता है और एक रिसेप्टर कई odorants 2 डिग्री बदलती करने के लिए बाध्य कर सकते हैं का पालन करने के लिए सोचा है. सुविधा बायोकेमिकल संकेतन, और ligand बाध्यकारी अध्ययन किया गया है सबसे GPCRs के लिए बाहर ले heterologous कोशिकाओं का उपयोग कर. हालांकि odorant रिसेप्टर्स के अध्ययन के लिए heterologous कोशिकाओं का उपयोग, एक लंबे समय के लिए रोका गया था के बाद से अभिकर्मक पर वे सतह के लिए निर्यात करने में विफल रहा है. Saito एट अल एक झिल्ली से गुजारें प्रोटीन रिसेप्टर (RTP) परिवहन परिवार संरक्षिकाओं घ्राण न्यूरॉन्स संवेदी heterologous कोशिकाओं में सतह, जब सह एक साथ 3 ट्रांसफ़ेक्ट यातायात odorant रिसेप्टर्स संरक्षिकाओं के रूप में कार्य में बढ़ाया अभिव्यक्ति का प्रदर्शन किया है. Heterologous कोशिकाओं का उपयोग रिसेप्टर्स के लिए जैव रासायनिक assays बाहर ले करने के लिए, एक पहले अगर रिसेप्टर सेल लाइन में मजबूत सतह अभिव्यक्ति से पता चलता है यह निर्धारित करना चाहिए. यह निगरानी RTP1S रहते fluorescently कोशिकी डोमेन या बाह्य डोमेन में विशेष रूप से एक टैग लेबल धुंधला सेल द्वारा पीछा के साथ रिसेप्टर्स overexpressing assayed द्वारा किया जा सकता है है. यहाँ हम एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए बाहर रहते सेल धुंधला हो जाना है कि HEK293T कोशिकाओं की सतह पर odorant रिसेप्टर्स सुविधा का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ले. इसके अलावा, यह भी अन्य chemosensory रिसेप्टर्स या GPCRs की सतह अभिव्यक्ति के लिए परख के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
1. प्रक्रिया:
प्रक्रिया तीन 3 दिनों के कुल समय पर पूरा भागों के शामिल हैं: कोशिकाओं के हस्तांतरण, अभिकर्मक और immunocytochemistry, एक कदम प्रति दिन बाहर किए गए. और पहले दो दिनों में कक्षों की अभिकर्मक स्थानांतरण एक लामिना का प्रवाह चैम्बर में बाँझ परिस्थितियों में किया जाना चाहिए.
दिन 1: सतह अभिव्यक्ति परख के लिए HEK293T कोशिकाओं का स्थानांतरण.
- स्थानांतरण (M10) मध्यम: 10% (मात्रा से) बाँझ हालत में भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ न्यूनतम आवश्यक पूरक मध्यम मिक्स.
- एक 100mm संस्कृति की थाली में एक वांछित confluency कोशिकाओं को स्थापित करने के लिए आवश्यक प्लेटों की संख्या के आधार पर आगे बढ़ें. ऊंचा हो गया या विरल कोशिकाओं से बचने के लिए हस्तांतरित किया जा कोशिकाओं के अंश निर्धारित करने के लिए यह महत्वपूर्ण है: उदाहरण के लिए, एक 100% मिला हुआ 100 मिमी पकवान से, एक एक 35 मिमी डिश के बारे में 3% हस्तांतरण में लगभग 30% confluency प्राप्त कर सकते हैं उत्तरार्द्ध.
- पहले कोशिकाओं बाँझ लामिना का प्रवाह चैम्बर, 22 कोट में स्थानांतरित बाँझ पाली डी lysine (1mg / एमएल) और प्रत्येक 35 मिमी सेल संस्कृति डिश में एक जगह है, चढ़ाना कोशिकाओं के लिए लेपित पक्ष के साथ एक्स 22 मिमी गिलास को कवर फिसल जाता है (चित्रा 1 ). 10 मिनट - 5 के लिए सूखी समाधान की अनुमति दें. इस अंतराल के दौरान, लामिना कक्ष में यूवी स्रोत चालू किया जा सकता है को कवर फिसल जाता है बाँझ, अगर वांछित. पाली डी lysine heterologous कोशिकाओं फिसल जाता है कवर करने के लिए छड़ी में मदद करता है.
- कोशिकाओं को हस्तांतरण करने के लिए, 100mm थाली में मौजूदा मीडिया aspirate, ध्यान से 8 एमएल बाँझ पीबीएस, aspirate पीबीएस जोड़कर धो और 3 एमएल 0.05% trypsin - EDTA का उपयोग कोशिकाओं trypsinize, जब कोशिकाओं को पकवान से अलग करके आगे enzymatic प्रतिक्रिया ब्लॉक 5 एमएल M10 जोड़ने. कोशिकाओं Triturate और एक बाँझ शंक्वाकार ट्यूब अपेक्षित मात्रा स्थानांतरण, 200g पर गोली कोशिकाओं के लिए 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. Trypsin - EDTA युक्त सतह पर तैरनेवाला Aspirate, कक्षों की गोली बरकरार जा. कोशिकाओं के लिए 35 मिमी व्यंजन हस्तांतरण के लिए हर डिश के लिए 1 M10 एमएल जोड़ सकते हैं और कोशिकाओं को अलग कर देना triturate. प्रत्येक पकवान resuspended कोशिकाओं के 1 एमएल जोड़ें. 37 में सेते रातोंरात कोशिकाओं ° सी, 5% सीओ 2.
चित्रा 1 22 कोट एक्स पाली डी lysine और प्रत्येक 35 मिमी पकवान में एक लेपित पक्ष जगह के साथ 22 मिमी कांच coverslips .
दिन 2: HEK293T कोशिकाओं के अभिकर्मक.
- हस्तांतरण के बाद 18-24 घंटे, कोशिकाओं assayed हो रिसेप्टर के अभिकर्मक के लिए तैयार हैं. रिसेप्टर और स्तनधारी अभिव्यक्ति वेक्टर PCI, बैक्टीरियल Qiagen Miniprep किट निम्नलिखित 4 से पहले वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग संस्कृतियों से तैयार क्लोन RTP1S का उपयोग करें. रिसेप्टर्स कि एन टर्मिनली 20 अमीनो एसिड लंबे rhodopsin मिलान के साथ टैग कर रहे हैं के लिए immunostaining की सुविधा का प्रयोग करें.
- रिसेप्टर का निर्माण, RTP1S निर्माण के 250 एनजी और हरी प्रतिदीप्ति प्रोटीन प्रत्येक अभिकर्मक के 50 एनजी 1000ng का उपयोग करें. निर्माताओं पुस्तिका के अनुसार 2000 Lipofectamine, का उपयोग अभिकर्मक प्रदर्शन.
3 दिन: सेल सतह दाग रिसेप्टर्स कल्पना Immunocytochemistry.
- शुरू करने के लिए पहले धुंधला हो जाना और धोने के समाधान तैयार करने और उन्हें डिग्री सेल्सियस 4 शांत करने के लिए मध्यम धुंधला: न्यूनतम आवश्यक मध्यम, 45 एमएल, भ्रूण गोजातीय सीरम, 5 एमएल (1M) HEPES, 500 μL (अंतिम एकाग्रता 10mm), सोडियम azide (1.5M), 500 μL (अंतिम 15mm एकाग्रता). धो: समाधान, HEPES (1M), 5 एमएल (अंतिम एकाग्रता 10mm) HBSS, सोडियम azide (1.5M), 5 एमएल (अंतिम 15mm एकाग्रता), 500 एमएल. दोनों के समाधान के पुन: उपयोग के लिए 4 ° C पर भंडारित किया जा सकता है. धुंधला मध्यम 100 गुना में आवश्यक एंटीबॉडी गिराए द्वारा एंटीबॉडी समाधान तैयार करें.
- 24 घंटे के बाद अभिकर्मक के बारे में odorant रिसेप्टर्स के लिए सतह धुंधला के लिए immunochemistry प्रारंभ. रहते सेल धुंधला हो जाना, प्रयोगात्मक सेट अप 4 करने के लिए ठंडा होना चाहिए प्रदर्शन डिग्री सेल्सियस: भरने के एक बड़े बर्फ के साथ रखी जाती है और इसे बनाने के रूप में संभव के रूप में भी बर्फ की सतह पॅट, बर्फ पर एक ट्रे जगह है और यह 70% के साथ स्प्रे इथेनॉल. Parafilm का एक टुकड़ा (ट्रे की लंबाई की तुलना में छोटे) और यह छिड़काव इथेनॉल ट्रे पर प्रत्यय कट, एक चिकनी सतह प्राप्त करने के लिए. स्थानांतरण गिलास को कवर parafilm पर ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं, एक समय में, सेल की ओर से युक्त, चिमटी का उपयोग कर निकल जाता है. परत 100 μL ठंड प्राथमिक धुंधला समाधान के साथ प्रत्येक को कवर पर्ची, पर्ची (चित्रा 2) के एक कोने से ध्यान extruding. एंटीबॉडी समाधान के साथ कवर फिसल जाता है layering के बाद, के लिए हवा में समाधान के सुखाने को रोकने के लिए ट्रे कवर. 45-60 मिनट के लिए प्राथमिक ऊष्मायन कैर्री.
- प्राथमिक ऊष्मायन के बाद, जल्दी मूल 35 मिमी संस्कृति व्यंजन को कवर फिसल जाता है हस्तांतरण, मीडिया युक्त. मीडिया Aspirate और 2 एमएल ठंडा धोने समाधान धीरे पकवान के किनारे से कवर पर्ची से कोशिकाओं को खोने को रोकने के जोड़. धोने समाधान Aspirate और दो बार दोहराने के लिए तीन washes पूरा. तीसरे धोने के अंत में, धोने के समाधान aspirate बाहर नहीं करते.
- माध्यमिक एंटीबॉडी soluti तैयारधुंधला मीडिया में और धोने समाधान से कवर फिसल जाता है एक ही ट्रे में एक नव चिपका parafilm परत करने के लिए स्थानांतरण. फिर धीरे एंटीबॉडी समाधान की परत करने के लिए प्राथमिक ऊष्मायन की तरह कोने से प्रत्येक को कवर पर्ची, 100 μL हटा. 30 के लिए माध्यमिक ऊष्मायन बाहर कैर्री - 45 मिनट और धोने के समाधान के लिए मूल 35 मिमी बर्तन में वापस हस्तांतरण. एक बार और, कवर धो तीन बार फिसल जाता है के रूप में वर्णित है.
- पिछले धोने से समाधान धोने और 2 एमएल 1% ठंडा paraformaldehyde जोड़ने Aspirate. ठंडा 1% paraformaldehyde समाधान में कोशिकाओं को 15 मिनट के लिए बर्फ पर फिक्स है.
- स्वच्छ माइक्रोस्कोप कांच के कवर पर फिसल जाता है माउंट बढ़ते अभिकर्मक Mowiol का उपयोग कर स्लाइड, सेल पक्ष के साथ नीचे और सावधानी से बाहर सभी हवाई बुलबुले (चित्रा 3). एक बार Mowiol हवा dries, कवर फिसल जाता है धोने धीरे सतह पर आसुत पानी जोड़ने और तुरंत aspirating.
चित्रा 2 100 μL ठंड प्राथमिक धुंधला समाधान के साथ प्रत्येक coverslip परत .
चित्रा 3. सेल पक्ष के साथ स्वच्छ कांच खुर्दबीन पर coverslips नीचे माउंट Mowiol बढ़ते अभिकर्मक का उपयोग कर स्लाइड.
2. प्रतिनिधि परिणाम:
संरक्षिकाओं (इस मामले odorant Olfr62 रिसेप्टर प्रोटीन RTP1S परिवहन के साथ रिसेप्टर में) (चित्रा 4) के साथ रिसेप्टर्स की अभिकर्मक पर लाइव सेल धुंधला कोशिकाओं की सतह पर प्रोटीन कल्पना करने के लिए एक सक्षम बनाता है. सेल रिसेप्टर्स की सतह धुंधला धुंधला के कबरा पैटर्न (4B चित्रा, इनसेट) द्वारा विशेषता है. धुंधला बाहर किया जाता है अनुपयुक्त अधिक शोर करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं, यह मुश्किल के लिए पर्यवेक्षक शोर से वास्तविक सतह धुंधला भेद करने के लिए बनाने के लिए. 
संरक्षिकाओं के साथ रिसेप्टर्स की चित्रा 4. अभिकर्मक रहते सेल धुंधला का उपयोग कोशिकाओं की सतह पर प्रोटीन के दृश्य के लिए अनुमति देता है. Odorant Olfr62 अकेले रिसेप्टर (ए) RTP1S निगरानी (बी) के साथ और Olfr62 के अभिकर्मक के अभिकर्मक. GFP अभिव्यक्ति के स्तर को एक अभिकर्मक नियंत्रण (ए 'और बी) के रूप में सेवा करते हैं.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
हर कदम से बाहर किया जाना चाहिए ध्यान से प्रमुख और विशिष्ट सतह धुंधला हो जाना सुनिश्चित है. पूरे धुंधला प्रक्रिया ठंड में बाहर किया जाना चाहिए (बर्फ पर), और ट्रे कवर फिसल जाता है जिस पर रखी हैं पहले ठंडा किया जाना चाहिए सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं को जीवित रहने के लिए उपयोग. इसके अलावा निर्धारण सतह धुंधला प्रक्रिया के अंत में किया जाता है. यह आंतरिक धुंधला जहां निर्धारण करने के लिए प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी के लिए कोशिका झिल्ली permeabilize धुंधला पछाड़ के साथ इसके विपरीत में है. सूखने से कोशिकाओं को रोकने के कवर फिसल जाता है हवा के लिए जोखिम के समय कम से कम किया जाना चाहिए, इसलिए एंटीबॉडी समाधान के साथ कवर फिसल जाता है के layering, कवर फिसल जाता है स्थानांतरित करने के लिए समाधान धो, washes के बीच धोने के समाधान के आदान - प्रदान एक समय में जल्दी और एक किया जाना चाहिए जब एकाधिक कवर फिसल जाता है से निपटने.
मिलान टैग और एंटीबॉडी एक का उपयोग करता है पर निर्भर करता है, एक ऊष्मायन समय, washes की संख्या, और एंटीबॉडी के कमजोर पड़ने के गुना समायोजित हो सकता है. पृष्ठभूमि शोर एंटीबॉडी गिराए या अधिक washes की संख्या बढ़ रही है, या ऊष्मायन समय छोटा करने से बचा जा सकता है.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
हम इस पांडुलिपि की महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Matsunami प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
