Summary
우리가 편리하게 HEK293T 세포의 표면에 odorant 수용체를 감지하는 데 사용할 수있는 라이브 세포 얼룩을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한, 그것은 또한 다른 chemosensory 수용체 또는 GPCRs의 표면 표현 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
냄새의 생생한 세상은 후각의 감각에 의해 인식됩니다. 생쥐의 후각은 휘발성 odorant 분자 바인딩하는 postulated 및 G 단백질과 결합하여 Gαolf 세포내 신호에 세포 신호를 변환하는 1200에 대한 G 단백질 결합 수용체의 (GPCRs) 1 레파토리에 의해 중재됩니다. 수용체에 odorants의 바인딩하면 하나 odorant 여러 수용체를 묶어 수 있습니다 한 수용체가도 2 다양한 여러 odorants를 바인딩 수있는 조합 규칙을 따를 생각입니다. 생화학, 신호 및 리간드 바인딩 연구 편리 heterologous 세포를 사용하는 대부분의 GPCRs에 대한 실시되었습니다. transfection에 그들은 표면에 수출하는 데 실패 때문에 그러나, odorant 수용체의 연구 heterologous 세포의 사용은 오랫동안 배제되었다. 사이토 외 가족 보호자들이 공동으로 함께 3 transfected heterologous 세포의 표면에 트래픽 odorant 수용체에 보호자로 후각 감각 뉴런과 행동의 강화된 표현을 보여주 단백질을 운반 단일 막 통과 수용체 (RTP)을 증명하고있다. 수용체는 세포 라인의 강력한 표면 표현을 보여주는 경우 heterologous 세포를 이용하여 수용체에 대한 생화 학적 assays을 수행하는 하나 먼저 확인해야합니다. 이것은 찬란 독점적으로 세포외 도메인의 세포외 도메인이나 태그를 레이블에 얼룩 라이브 셀 다음에 보호자의 RTP1S와 overexpressing 수용체에 의해 assayed 수 있습니다. 우리가 편리하게 HEK293T 세포의 표면에 odorant 수용체를 감지하는 데 사용할 수있는 라이브 세포 얼룩을 수행하는 프로토콜을 보여줍니다. 또한, 그것은 또한 다른 chemosensory 수용체 또는 GPCRs의 표면 표현 분석하는 데 사용할 수 있습니다.
Protocol
1. 절차 :
절차는 삼일 총 시간이 지남에 따라 완성된 세 부분으로 구성되어 전송 세포 transfection과 immunocytochemistry, 하루에 실시 한 걸음. 처음 두 일 동안 전송 및 세포의 transfection은 층류 챔버에 무균 상태에서 실시해야합니다.
1 일 : 표면 표현 분석에 대한 HEK293T 세포의 양도.
- 전송 매체 (M10) : 믹스 10 % (부피가) 무균 상태에서 태아 소 혈청과 보충 최소 필수적인 매체.
- 설정하는 데 필요한 접시의 숫자에 따라, 100mm 문화 판에서 원하는 confluency에 세포를 성장. 자란 또는 스파스 세포를 피하로 전송하는 세포의 분율을 결정하는 것이 중요합니다 : 예를 들어, 100 % 합류 100mm 요리에서, 하나는의 30 % confluency를 구하는 35mm 요리로 약 3 %를 양도할 수 있습니다 후자.
- 이전 멸균 층류 챔버, 코트 22, 세포를 전송 멸균 폴리 D 라이신 (1mg / ML) 각 35mm의 세포 배양 접시에서 개최 한 도금 전지 코팅 측면까지 함께 X 22mm 유리 커버 풀렸는데 (그림 1 ). 십분 - 5 건조에 대한 해결책을 허용합니다. 원하는 경우이 간격 동안 판상 챔버의 자외선 소스, 커버 전표를 소독에 설정되어있을 수 있습니다. 폴리 라이신은 D heterologous 세포 커버 전표에 충실하는 데 도움이됩니다.
- 세포를 전송하려면, 100mm 접시에있는 기존의 미디어를 대기음, 조심스럽게 8 ML 멸균 PBS, 대기음 PBS를 추가하여 씻어 3 ML에게 0.05 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 사용하여 세포를 trypsinize, 세포 접시에서 분리하면에 의해 추가로 효소 반응을 차단 5 ML의 M10을 추가. 세포를 씹다하고 살균 원뿔 관에 필요한 볼륨을 전송, 펠릿 세포 5 분 200g에 원심 분리기. 세포의 펠렛은 그대로두고, 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)를 포함 뜨는을 대기음. 35mm 요리에 세포를 전송하려면 각 접시 1 ML M10를 추가하고 세포를 떼어 놓다을 씹다. 각 접시에 resuspended 세포 1 ML을 추가합니다. 37 밤새 품어 세포 ° C, 5 % CO 2.
그림 1. 코트 22 폴리 라이신 D 각 35mm 접시에 놓으 코팅 측면을 함께 X 22mm의 유리 coverslips.
일 2 : HEK293T 세포의 Transfection.
- 전송 후 18~24시간은 전지 assayed 수 수용체의 transfection에 대한 준비가되어 있습니다. 수용체 4 언급한 Qiagen Miniprep 키트 다음과 같은 프로토콜을 사용하여 세균의 문화에서 준비 포유류의 표현 벡터 PCI에서 복제 RTP1S을 사용합니다. N 말기 immunostaining을 촉진 20 아미노산 긴 rhodopsin 에피토프가 추가됩니다 수용체를 사용하십시오.
- 수용체 구조, RTP1S 구조 250 NG와 녹색 형광 단백질 각각 transfection 50 NG의 1000ng를 사용하십시오. 제조 업체의 설명서를 따라 같은 Lipofectamine 2000을 사용하여 transfection을 수행합니다.
3 일 : 세포 표면 수용체 자국을 시각화하기 위해 Immunocytochemistry.
- 시작하기 전에하는 얼룩 및 솔루션을 씻고 준비를 4 ° C. 그들을 냉각 매체 얼룩 : 최소 필수 중간, 45 ML, 태아 소 혈청, 5 ML, HEPES (1M), 500 μL (최종 농도 10mM), 나트륨 Azide (1.5M), 500 μL (최종 농도 15mM). ; HEPES (1M), 5 ML (최종 농도 10mM), 나트륨 Azide (1.5M), 5 ML (최종 농도 15mM) HBSS, 500 ML : 솔루션을 씻으십시오. 두 솔루션은 재사용 4 ° C에 저장된 수 있습니다. 얼룩 매체 100 배에 필요한 항체를 diluting하여 항체 솔루션을 준비합니다.
- 24 시간 게시 transfection에 대한 odorant 수용체에 대한 표면 얼룩에 대한 immunochemistry를 시작합니다. 라이브 세포 얼룩, 4 냉각해야 최대 실험 설정을 수행하려면 ° C : 입력 대형 얼음 포함되어 등도 가능한 한 그것을 만들기 위해 얼음의 표면을 두드려, 얼음에 트레이를 배치 70 %를를 스프레이 에탄올. 부드러운 표면을 얻기 위해, parafilm의 조각 (트레이의 길이보다 작은)와 에탄올 물을 뿌리면 트레이에 부착 그것을 잘라. 유리 커버가 핀셋을 사용하여 parafilm에 transfected 세포, 한 번에 하나, 세포 측면을 포함하는 전표 전송합니다. 레이어 각각의 커버 슬립 (그림 2)의 일각에서 조심스럽게 압출, 100 μL 차가운 차 얼룩 솔루션 전표. 겹겹이 항체 솔루션으로 모든 표지 풀렸는데 후, 공기 솔루션의 최대 건조 방지하기 위해 트레이를 다룹니다. 45-60분에 대한 기본 부화를 수행합니다.
- 기본 부화 후, 신속하게 미디어를 포함, 원래 35mm 문화 요리 커버 전표를 전송할 수 있습니다. 미디어를 기음과 커버 슬립의 세포를 잃는 것을 방지하기 위해 접시의 가장자리에서 천천히 두 ML 차게 씻어 솔루션을 추가합니다. 세차 솔루션을 기음 세 세척을 완료하는 두 번 반복합니다. 세 번째 세척의 끝에서 씻어 솔루션을 대기음하지 않습니다.
- 이차 항체 soluti 준비얼룩 미디어에서와 같은 트레이에 새로 부착된 parafilm 레이어로 세척 솔루션에서 커버 전표를 전송할 수 있습니다. 다시 부드럽게 레이어 기본 부화 같은 코너에서 각 커버 슬립을하는 항체 용액 100 μL를 돌출. 30 차 배양을 수행 - 45 분 거리에 있으며 원래 35mm 요리에서 세척 솔루션에 다시 전송할 수 있습니다. 한 번 더, 뚜껑이 설명한대로 세 번 전표 씻으십시오.
- 마지막으로 씻어에서 솔루션을 씻어 2 ML 1퍼센트 차게 paraformaldehyde를 추가 대기음. 15 분 동안 얼음에 차게 1 % paraformaldehyde 용액에 세포를 수정.
- 깨끗한 현미경 유리에 커버 전표를 마운트 다운 세포 측면으로 장착 시약의 Mowiol를 사용하고 신중하게 모든 공기 방울 (그림 3)을 제외 슬라이드. 일단 Mowiol 공기 증발, 표면에 증류수를 추가하고 즉시 aspirating하여 부드럽게 커버 전표를 씻으십시오.
그림 2. 층 100 μL 차가운 차 얼룩 솔루션으로 각 coverslip.
그림 3. 깨끗한 유리 현미경 아래에서 셀 사이드로 coverslips을 마운트 Mowiol 장착 시약을 사용하여 슬라이드.
2. 대표 결과 :
라이브 세포 얼룩은 보호자 (수용체 운반 단백질 RTP1S이 경우 odorant 수용체 Olfr62에서) (그림 4)와 수용체의 transfection에 세포의 표면에 단백질을 시각화 한 수 있습니다. 수용체의 세포 표면 얼룩은 얼룩의 작은 반점이있는 패턴 (그림 4B, 삽입된 페이지)에 의해 특징입니다. 얼룩은 어렵게 관찰자가 소음에서 실제 표면 얼룩을 구분하는 만들기, 부적절하게 높은 노이즈가 발생할 수 있습니다 진행. 
보호자와 수용체의 그림 4. Transfection 살 세포 얼룩을 사용하여 세포의 표면에 단백질의 시각화를위한 수 있습니다. RTP1S의 보호자 (B)와 odorant의 혼자 수용체 Olfr62 (A)와 Olfr62의 transfection의 Transfection. GFP 표현 수준 transfection 제어 (A '와 B') 역할을합니다.
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Discussion
각 단계는 두드러진과 독특한 표면 얼룩을 보장하기 위해 신중하게 진행되어야합니다. 전체 얼룩 과정 (얼음) 추위에 실시해야하며 커버 전표가 마련하고있는 트레이는 세포가 살아있을 수 있도록 사용하기 전에 냉각해야합니다. 또한 고정은 표면 얼룩 프로세스의 끝에 이루어집니다. 이것은 고정은 기본 및 보조 항체로 세포막을 permeabilize에 얼룩 앞에 내부 얼룩과 선명한 대조이다. 공기 커버 전표의 노출 시간이 최대 건조에서 세포를 방지하기 위해 최소화되어야하며 항체 솔루션으로 커버 전표의 우위를 겹겹이, 솔루션을 씻어 표지 전표 전송, 세척 사이 씻어 솔루션의 교환은 한 번에 빠르게 한 이루어져야합니다 여러 개의 커버 전표를 다룰 때.
에피토프 태그와 항체 일 사용에 따라, 하나는 부화 시간, 세척의 수를, 그리고 항체 희석의 접을를 조정해야 할 수도 있습니다. 배경 잡음은 항체를 더 diluting 또는 세척의 수를 증가하거나, 부화 시간을 단축함으로써 피할 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
우리는이 원고의 중요한 읽기위한 마츠 실험실의 구성원 감사합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
