Summary
Burada odorant reseptörleri HEK293T hücrelerinin yüzeyinde rahatlıkla tespit etmek için kullanılan olabilir canlı hücre boyama yürütmek için bir protokol göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda, diğer kimyasal-duyusal reseptörleri veya GPCRs yüzey ekspresyonu tahlil için kullanılır.
Abstract
Kokuları koku alma duygusunu canlı dünya tarafından kabul edilmektedir. Farelerde koku, uçucu odorant molekülleri bağlamak için öne ve G proteini Gαolf ile kaplin bir hücre içi sinyal ekstraselüler sinyal dönüştürme yaklaşık 1200 G Protein Coupled reseptörleri (GPCRs) 1 bir repertuar ile meydana gelir . Koku reseptörleri bağlayıcı, çeşitli reseptörler bir odorant bağlamak ve bir reseptör derece 2 değişen çeşitli koku bağlamak Kombinatoryal kural takip etmek düşünülmektedir. Biyokimyasal, sinyalizasyon ve ligand bağlanma çalışmaları uygun heterolog hücreleri kullanarak en GPCRs için yürütülen edilmiştir. Ancak, transfeksiyon yüzeye ihracat başarısız beri odorant reseptörlerinin çalışma için heterolog hücrelerinin uzun bir süre engellediği. Saito et al aile şaperonlar co birlikte 3 transfekte heterolog hücrelerinin yüzeyinde, trafik odorant reseptörleri şaperonlar olarak koku duyusal nöronlar ve hareket gelişmiş ifade Protein taşınması tek zarından geçişine Reseptör (RTP) göstermiştir. Reseptör hücre hattı sağlam yüzey ekspresyonu gösterir heterolog hücreleri kullanarak reseptörleri için biyokimyasal testleri yürütmek için bir ilk belirlemeniz gerekir. Bu canlı hücre floresan ekstrasellüler özel ekstrasellüler etki alanı veya bir etiket etiket boyama takip şaperon RTP1S reseptörleri eksprese tarafından test edilebilir. Burada odorant reseptörleri HEK293T hücrelerinin yüzeyinde rahatlıkla tespit etmek için kullanılan olabilir canlı hücre boyama yürütmek için bir protokol göstermektedir. Buna ek olarak, aynı zamanda, diğer kimyasal-duyusal reseptörleri veya GPCRs yüzey ekspresyonu tahlil için kullanılır.
Protocol
1. Prosedür:
Bu prosedür, 3 gün toplam zaman içinde tamamlandı üç bölümden oluşmaktadır: hücrelerinin transferi, transfeksiyon ve immünhistokimya Hergün yürütülen bir adım. Ilk iki gün içinde transferi ve hücrelerin transfeksiyon laminer akış odasında steril şartlarda yapılmalıdır.
1. Gün: yüzey ifade testi için HEK293T hücre aktarın.
- Transferi orta (M10):% 10 (hacimce) steril durumda fetal sığır serumu ile takviye asgari temel orta karıştırın.
- Kurmak için gerekli olan plakaların sayısına bağlı olarak, istenen bir confluency 100mm bir kültür plakasına hücreleri büyütün. Büyümüş veya seyrek hücreler önlemek için transfer edilecek hücreler kısmını belirlemek için önemlidir: örneğin,% 100 konfluent 100 mm çanak, yaklaşık% 30 confluency elde etmek için 35 mm çanak yaklaşık% 3 devredebilir ikincisi.
- Önce transfer, hücreler steril laminar akış odası, mont 22 X 22 mm steril poli D lisin (1 mg / ml) ve her biri 35 mm hücre kültürü çanak yer kaplama hücreler için çift tarafı kaplı cam kapak fişleri (Şekil 1 .) 10 dakika - 5 kuruması için çözüm izin verin. Bu süre zarfında, laminer odasında UV kaynak, istenirse kapak fişleri sterilize etmek için açık olabilir. Poly-Ge lisin heterolog hücrelerinin kapak fişleri sopa yardımcı olur.
- Hücreleri aktarmak için, 100mm çanak mevcut medya aspirat, 8 mL steril PBS, aspirat PBS ekleyerek dikkatlice yıkayın ve 3 ml% 0.05 tripsin-EDTA kullanarak hücrelerin trypsinize; hücreleri çanak ayırmak, daha fazla enzimatik reaksiyonu engellemek 5 ml M10 sözlerine ekledi. Hücreleri Karışım ve steril konik tüp Koşul hacim transferi; pelet hücreleri için 5 dakika için 200 gr santrifüj. Hücre pelet zedelemeden, tripsin-EDTA içeren süpernatant aspire. 35 mm yemekleri hücreleri aktarmak için, her yemek için 1 ml M10 ekleyin ve hücreleri ayırmak çiğnemek. Her çanak yeniden süspanse hücrelerinin 1 ml ekleyin. 37 geceleme inkübe hücreleri ° C,% 5 CO 2.
Şekil 1. Kat 22 poli D lisin ve her biri 35 mm çanak kaplı yüzü yukarı X 22 mm cam lamelleri.
2. Gün: HEK293T hücrelerinin Transfeksiyon.
- Aktarıldıktan sonra 18-24 saat, hücre reseptör çalışılmalıdır transfeksiyon için hazır. Reseptör ve 4 önce açıklanan Qiagen Miniprep Kit aşağıdaki protokol kullanarak bakteri kültürleri hazırlanan memeli ekspresyon vektörü PCI klonlanmış RTP1S kullanın. K ölümcül immün kolaylaştırmak için 20 amino asit uzunluğundaki rodopsin epitopu ile etiketlenmiş reseptörleri kullanın.
- Reseptör inşa, 250 ng RTP1S inşa ve 50 ng yeşil floresan protein her transfeksiyon 1000ng kullanın. Üreticileri kılavuzuna göre Lipofectamine 2000, transfeksiyon kullanarak gerçekleştirin.
3. Gün: hücre yüzeyi boyanan reseptörleri görselleştirmek için İmmünositokimya.
- Başlamadan önce, boyama ve yıkama çözümler hazırlamak ve 4 ° C'ye kadar soğutmak Boyama orta: Minimum Essential Medium, 45 mL; fetal sığır serumu, 5 ml; Hepes (1M), 500 mcL (nihai konsantrasyon 10mM); Sodyum Azid (1,5 M), 500 mcL (son konsantrasyon 15mm). Hepes (1M), 5 ml (son konsantrasyonu 10mM); Sodyum Azid (1,5 M), 5 ml (son konsantrasyon 15mm) HBSS, 500 ml: çözüm yıkayın. Her iki çözüm de yeniden kullanım için 4 ° C'de muhafaza edilebilir. 100 kat boyama orta gerekli antikorları seyreltilmesi ile antikor çözümler hazırlayın.
- 24 saat transfeksiyon hakkında odorant reseptörleri yüzey boyama için immünokimyanın başlatın. Canlı hücre boyama, 4 soğutmalı olmalıdır deney gerçekleştirmek için ° C doldurmak büyük bir buz bulunan ve mümkün olduğunca düz hale getirmek buz yüzey pat, buz üzerinde bir tepsiye yerleştirin ve% 70 ile sprey etanol. Düzgün bir yüzey elde etmek için, bir parafilm parça (tepsinin uzunluğundan daha küçük) ve etanol püskürtülür tepsi yapıştırmayın kesin. Cam kapak, cımbız kullanarak parafilm transfekte hücreler, her seferinde bir hücre yan içeren fişleri aktarın. Katman her kapak kayma (Şekil 2) bir köşesine özenle ekstrüzyon, 100 mcL soğuk birincil boyama çözüm kayma. Katmanlama antikor çözümü ile tüm kapak fişleri sonra, hava çözüm kurumasını önlemek için tepsisi kapağı. 45-60 dakika için birincil inkübasyon yürütmek.
- Birincil inkübasyondan sonra, hızlı bir şekilde, medya içeren orijinal 35mm kültür kaplarına kapak fişleri transfer. Aspire medya ve yemeğin kenarından hafifçe kapak kayma hücreleri kaybını önlemek için 2 mL soğuk yıkama çözeltisi ekleyin. Yıkama solüsyonu aspire edin ve üç yıkar tamamlamak için iki kez tekrarlayın. Sonunda üçüncü yıkama, yıkama solüsyonu aspire yok.
- Ikincil antikor hazırlayın solutiboyama medya ve aynı kasetten yeni yapıştırılmış parafilm tabakası yıkama solüsyonu kapak fişleri transferi. Yine yavaşça 100 mcL birincil inkübasyon gibi köşesinden her kapak kayma tabakası antikor çözüm a'ya. 30 ikincil inkübasyon yürütmek - 45 dakika ve 35 mm orijinal yemekler yıkama solüsyonu transferi geri. Bir kez daha, açıklandığı gibi üç kez kayar kapak yıkayın.
- Aspire son yıkama çözüm yıkayın ve 2 ml% 1 soğutulmuş paraformaldehid eklemek. 15 dakika boyunca buz üzerinde soğutulmuş% 1 paraformaldehid çözüm hücreleri sabitleyin.
- Mount temiz mikroskop cam kapak fişleri hücre yüzü aşağı, montaj reaktif Mowiol kullanarak ve dikkatli tüm hava kabarcıkları (Şekil 3) hariç slaytlar. Bir kez Mowiol hava kurur, yüzey ve hemen aspire distile su ekleyerek kapağını yavaşça fişleri yıkayın.
Şekil 2 Katman 100 mcL soğuk birincil boyama çözümü ile her lamel.
Şekil 3. temiz cam mikroskop hücre yüzü aşağı Mount lamelleri Mowiol montaj reaktifi kullanılarak kayar.
2. Temsilcisi Sonuçlar:
Canlı hücre boyama şaperonlar (protein RTP1S Reseptör taşınması ile bu durumda odorant reseptör Olfr62) (Şekil 4) reseptörlerinin transfeksiyon, hücrelerin yüzeyindeki proteinler görselleştirmek için bir olanak sağlar. Reseptörlerinin hücre yüzeyi boyama boyama noktalı desen (Şekil 4B, içerlek) ile karakterizedir. Boyama, gözlemci, gürültüden gerçek yüzey boyama ayırt etmek zor yapma, uygunsuz yüksek gürültü yürütülen yol açabilir. 
Şekil 4 şaperonlar ile reseptörlerinin Transfeksiyon canlı hücre boyama kullanarak hücrelerin yüzeyindeki proteinler görselleştirme sağlar. Odorant RTP1S hastabakıcı (B) tek başına reseptör Olfr62 (A) ve Olfr62, transfeksiyon Transfeksiyon. GFP ifade düzeyleri transfeksiyon kontrolü (A 've B') olarak hizmet vermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Her adım, belirgin ve ayırt edici bir yüzey boyama sağlamak için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Tüm boyama işlemi soğuk (buz) yürütülen olmalıdır ve kapak fişleri hangi tepsiye serilir hücreleri hayatta kalmak sağlamak için kullanmadan önce soğutulması gerekir. Ayrıca fiksasyon yüzey boyama sürecinin sonunda yapılır. Bu fiksasyon birincil ve ikincil antikorlar hücre zarı permeabilize boyama önce iç boyası ile keskin bir kontrast. Hücreleri kurumasını önlemek için kapak fişleri havaya maruz kalma süresi en aza indirilebilir; bu nedenle antikor çözümleri ile kapak fişleri katmanlama çözüm yıkamak için kapak fişleri aktarımı, yıkama arasında yıkama solüsyonu değişimi, hızlı ve tek bir defada yapılabilir gerekir Birden fazla kapak fişleri işlerken.
Epitopu etiketi ve antikorlar sonucunda birini kullanır bağlı olarak, kuluçka süresi, yıkama sayısı ve kat antikor seyreltme ayarlamanız gerekebilir. Arka plan gürültüsü antikorlar daha fazla seyreltilmesi veya yıkama sayısını artırarak ya da kuluçka süresini kısaltarak önlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu yazının eleştirel okuma Matsunami laboratuvar üyelerine teşekkür ediyorum.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
