Summary
Ici nous démontrons un protocole pour mener à bien coloration de cellules vivantes qui peuvent être utilisés pour détecter les récepteurs olfactifs à la surface des cellules HEK293T commodément. En outre, il peut également être utilisé pour le dosage de l'expression de surface d'autres récepteurs chimiosensoriels ou RCPG.
Abstract
Le monde des odeurs vives est reconnu par le sens de l'olfaction. Olfaction chez la souris est médiée par un répertoire d'environ 1200 récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) 1 qui sont postulés pour lier les molécules odorantes volatiles et en convertissant le signal extracellulaire en signal intracellulaire par couplage avec la protéine G Gαolf. La liaison de l'odorants aux récepteurs est pensé pour suivre une règle combinatoire, qui est, un odorant peut lier plusieurs récepteurs et un récepteur peut se lier plusieurs molécules odorantes à des degrés divers 2. Biochimiques, la signalisation et des études de liaison ligand ont été commodément effectuée pour la plupart des RCPG en utilisant des cellules hétérologues. Cependant l'utilisation de cellules hétérologues pour l'étude des récepteurs olfactifs, a été exclue pour un temps depuis longtemps sur la transfection ils ont échoué à l'exportation vers la surface. Saito et al ont démontré seule récepteur membranaire passent protéine de transport (RTP) chaperons familiales montrent une expression accrue dans les neurones olfactifs sensoriels et d'agir comme accompagnateur à récepteurs olfactifs du trafic à la surface des cellules hétérologues, en cas de co transfectées ensemble 3. Pour mener à bien des dosages biochimiques des récepteurs utilisant des cellules hétérologues, on doit d'abord déterminer si le récepteur affiche l'expression en surface robuste dans la lignée cellulaire. Cela peut être dosé en surexprimant les récepteurs à la RTP1S chaperon suivie par coloration de cellules vivantes à fluorescence étiquette du domaine extracellulaire ou un tag dans le domaine extracellulaire exclusivement. Ici nous démontrons un protocole pour mener à bien coloration de cellules vivantes qui peuvent être utilisés pour détecter les récepteurs olfactifs à la surface des cellules HEK293T commodément. En outre, il peut également être utilisé pour le dosage de l'expression de surface d'autres récepteurs chimiosensoriels ou RCPG.
Protocol
1. Procédure:
La procédure comprend trois parties réalisé sur une durée totale de 3 jours: les cellules de transfert, la transfection et l'immunocytochimie, une étape menée par jour. Transfert et transfection de cellules au cours des deux premiers jours doit être effectué dans des conditions stériles dans une chambre à flux laminaire.
Jour 1: Transfert de cellules pour le dosage HEK293T expression à la surface.
- Le fluide caloporteur (M10): Mélanger milieu essentiel minimum supplémenté avec 10% (en volume) de sérum bovin fœtal à l'état stérile.
- Cultiver des cellules à une confluence souhaité dans une plaque de culture de 100 mm, selon le nombre de plaques nécessaires pour mettre en place. Il est important de déterminer la fraction de cellules pour être transféré à éviter des cellules envahies ou clairsemés: par exemple, à partir d'un 100% de confluence 100 mm plat, on peut transférer environ 3% à un plat de 35 mm afin d'obtenir environ 30% de confluence dans le celui-ci.
- Avant le transfert de cellules, dans la chambre de flux laminaire stérile, manteau 22 X 22 mm en verre glisse couvrir avec la lysine stériles poly D (1 mg / ml) et placer un dans chaque plat de 35 mm de culture cellulaire, face enduite pour plaquage cellules (figure 1 ). Laisser la solution à sec pendant 5 - 10 minutes. Durant cet intervalle, la source UV dans la chambre de laminaire peut être activée pour stériliser les lamelles, si désiré. Poly D lysine aide les cellules hétérologues coller à l'lamelles.
- Pour transférer des cellules, aspirer à des médias existants dans le plat 100mm, se laver en prenant soin d'ajouter 8 ml de PBS stérile, aspirer PBS et les cellules en utilisant trypsiniser 3 mL 0,05% de trypsine-EDTA; lorsque les cellules se détachent de la vaisselle, bloc de réaction enzymatique par d'autres ajoutant 5 ml M10. Triturer les cellules et le transfert du volume requis pour un tube stérile conique; centrifuger à 200g pendant 5 minutes pour sédimenter les cellules. Aspirer à surnageant contenant la trypsine-EDTA, laissant le culot de cellules intactes. Pour transférer les cellules à plaques de 35 mm, ajouter 1 ml M10 pour chaque plat et triturer à dissocier les cellules. Ajouter 1 mL de cellules en suspension à chaque plat. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C, 5% de CO 2.
Figure 1. Coat 22 X 22 mm avec des lamelles en verre poly D lysine et le lieu couché une face dans chaque plat de 35 mm.
Jour 2: La transfection de cellules HEK293T.
- 18-24 heures après le transfert, les cellules sont prêtes pour la transfection du récepteur à doser. Utilisez des récepteurs et RTP1S clonés dans le vecteur d'expression mammifère PCI, préparés à partir de cultures bactériennes en utilisant Qiagen Miniprep Kit protocole suivant décrit avant 4. Utilisez des récepteurs qui sont N terminale taggés avec 20 acides aminés à long épitope rhodopsine pour faciliter immunomarquage.
- Utilisez des 1000ng construire des récepteurs, 250 ng de RTP1S construire et 50 ng de protéine à fluorescence verte chaque transfection. Effectuer transfection en utilisant Lipofectamine 2000, conformément au manuel du fabricant.
Jour 3: immunocytochimie de visualiser les récepteurs de surface des cellules colorées.
- Avant de commencer, préparer la coloration et des solutions de lavage et de les refroidir à 4 ° C. Coloration moyennes: Minimum Essential Medium, 45 ml; sérum de veau fœtal, 5 ml; HEPES (1M), 500 ul (concentration finale 10 mM); azide de sodium (1,5 M), 500 ul (concentration finale 15 mM). Solution de lavage: HBSS, 500 ml; HEPES (1M), 5 ml (concentration finale 10 mM); azide de sodium (1,5 M), 5 ml (concentration finale 15 mM). Les deux solutions peuvent être conservés à 4 ° C pour les réutiliser. Préparer des solutions d'anticorps en diluant les anticorps nécessaires à moyen et coloration 100 fois.
- Démarrer immunochimie pour la coloration de surface pour les récepteurs olfactifs environ 24 heures après la transfection. Pour effectuer une coloration de cellules vivantes, le dispositif expérimental suivi doit être refroidi à 4 ° C: remplissez un grand contenu de glace et de Pat la surface de la glace pour la rendre aussi uniforme que possible, placez un bac sur la glace et de le vaporiser avec 70% l'éthanol. Coupez un morceau de parafilm (plus petit que la longueur du bac) et l'apposer sur le plateau de l'éthanol pulvérisé, pour obtenir une surface lisse. Transférer les lamelles de verre contenant des cellules transfectées sur le parafilm, un à la fois, côté pile, en utilisant une pince à épiler. Couche de chaque lamelle avec 100 uL solution de coloration à froid primaire, extrusion soin à partir d'un coin de la glisse (figure 2). Après superposition de tous les bordereaux de couvrir avec une solution d'anticorps, couvrir le bac pour éviter l'assèchement de la solution dans l'air. Effectuer une incubation primaires pendant 45-60 minutes.
- Après une incubation de primaire, de transférer rapidement des lamelles de la culture de plats originaux 35mm, contenant les médias. Aspirer les médias et ajouter 2 ml de solution de lavage refroidie doucement à partir du bord du plat pour éviter de perdre les cellules de la lamelle. Aspirer la solution de lavage et de répéter deux fois pour terminer trois lavages. A la fin du troisième lavage, ne pas aspirer la solution au lavage.
- Préparer anticorps secondaire solutidans les médias coloration et de transférer les lamelles de la solution de lavage à une couche de parafilm nouvellement apposée dans le même bac. Encore une fois délicatement extruder 100 uL de solution d'anticorps à la couche de chaque lamelle, à partir du coin, comme l'incubation primaire. Effectuer une incubation secondaire pour 30 - 45 minutes et transfert à la solution de lavage dans les 35 plats originaux mm. Une fois de plus, se laver le couvercle glisse trois fois comme décrit.
- Aspirer la solution de lavage du dernier lavage et ajouter 2 ml de paraformaldéhyde 1% réfrigérée. Fixer les cellules dans une solution de paraformaldéhyde réfrigérée à 1%, sur la glace pendant 15 minutes.
- Montez le couvercle glisse sur le verre de microscope propre diapositives à l'aide de réactifs de montage Mowiol, avec le côté pile vers le bas et prudemment exclure toutes les bulles d'air (figure 3). Une fois séché à l'air Mowiol, lavez délicatement lamelles en ajoutant de l'eau distillée sur la surface et aspirer immédiatement.
Figure 2. Couche de chaque lamelle avec 100 uL solution de coloration à froid primaire.
Figure 3. Monter les lamelles avec le côté pile vers le bas sur microscope en verre propres diapositives à l'aide de réactifs Mowiol montage.
2. Les résultats représentatifs:
Coloration des cellules en direct permet de visualiser les protéines à la surface des cellules, sur la transfection de récepteurs avec des chaperons (dans ce cas, des récepteurs olfactifs Olfr62, avec RTP1S récepteur protéique Transport) (figure 4). Coloration de la surface cellulaire des récepteurs est caractérisée par le modèle ponctuée de taches (figure 4B, en médaillon). Coloration effectué de façon inappropriée peut entraîner une augmentation du bruit, ce qui rend difficile pour l'observateur de distinguer la coloration de surface réelle du bruit. 
Transfection Figure 4. Des récepteurs avec des chaperons permet la visualisation des protéines à la surface des cellules utilisant une coloration de cellules vivantes. La transfection du récepteur odorant Olfr62 seul (A) et la transfection de Olfr62 avec chaperon RTP1S (B). Les niveaux d'expression de GFP servir de contrôle de transfection (A 'et B').
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Discussion
Chaque étape doit être réalisée avec soin pour s'assurer coloration de surface importante et distinctive. Le processus de coloration au complet doit être effectué à froid (sur glace), et le plateau sur lequel sont fixées des lamelles doit être refroidi avant de l'utiliser pour assurer les cellules rester en vie. Par ailleurs la fixation est effectuée à la fin du processus de coloration de surface. Ceci est en contraste frappant avec la coloration interne où la fixation précède coloration pour perméabiliser la membrane cellulaire pour les anticorps primaires et secondaires. Temps d'exposition des lamelles à l'air doit être minimisée pour empêcher les cellules de tarissement, par conséquent la superposition de lamelles avec les solutions d'anticorps, le transfert de lamelles à la solution de lavage, l'échange de solution de lavage entre les lavages doivent être effectués rapidement et un à la fois lors de la manipulation des lamelles multiples.
Selon le tag épitopes et les anticorps, on utilise, on peut avoir à ajuster le temps d'incubation, le nombre de lavages, et pli de dilution d'anticorps. Le bruit de fond peut être évitée en diluant l'anticorps plus ou en augmentant le nombre de lavages, ou le raccourcissement du temps d'incubation.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Nous remercions les membres du laboratoire pour Matsunami lecture critique de ce manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cover slip 22 X 22 mm (#1) | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 72200-11 | |
| Fetal bovine serum | GIBCO, by Life Technologies | 16000 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668-019 | |
| Minimal essential medium | Sigma-Aldrich | M4655 | With L glutamate, Earle’s salt and bicarbonate |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| Paraformaldehyde | EMS | 19208 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) 1X | GIBCO, by Life Technologies | 14025 | With calcium chloride and magnesium chloride |
| HEPES Buffer Solution | GIBCO, by Life Technologies | 15630 | |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Cellgro | 21-040-CV | Without calcium and magnesium |
| Poly D Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P7280 | |
| Sodium Azide | Electron Microscopy Sciences | SX0299-1 | |
| Tissue culture dish 35 X 10 mm | Falcon BD | 353801 | |
| Trypsin-EDTA | GIBCO, by Life Technologies | 25300 | 0.05% |
References
- Buck, L., Axel, R. A novel multigene family may encode odorant receptors: a molecular basis for odor recognition. Cell. 65, 175-187 (1991).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96, 713-723 (1999).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119, 679-691 (2004).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nat Protoc. 3, 1402-1413 (2008).
