Summary
Införandet av en gen av intresse i en cell är en kraftfull metod för att belysa dess funktion in vivo. Detta protokoll beskriver en effektiv metod för transfecting en kultur för mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs) med hjälp av Nucleofector elektroporation apparaten från Amaxa.
Abstract
Transfektion av primär däggdjur neurala celler, såsom mänskliga neurala stamceller / föregångare celler (hNSPCs), med vanliga katjoniska reagenser lipid transfektion har ofta resulterat i dålig cellviabiliteten och låg transfektion effektivitet. Andra mekaniska metoder för att införa en gen, till exempel en gen pistol eller mikroinjektion, begränsas också av dålig cellviabiliteten och lågt antal transfekterade cellerna. Strategin att använda virala konstruktioner att införa en exogen genen i galvaniska element har begränsade av både tid och arbete som krävs för att skapa virala vektorer och potentiella säkerhetsproblem. Vi beskriver här en steg-för-steg-protokoll för transfecting hNSPCs använda Amaxa är Nucleofector enhet och teknik med elektrisk ström parametrar och lösningar buffert speciellt optimerad för transfecting neurala stamceller. Användning av detta protokoll, har vi uppnått första transfektion effektivitet på ~ 35% och ~ 70% efter en stabil transfektion. Protokollet innebär att kombinera ett stort antal hNSPCs med DNA ska transfekterade i lämplig buffert följt av elektroporation med Nucleofector enheten.
Protocol
Obs: Se Passaging mänskliga neurala stamceller artikeln ( http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 ) och Counting mänskliga neurala celler Stem artikeln ( http://www.jove.com / index / Details.stp? ID = 262 ) att lära sig att resuspendera och räkna hNSPCs.
Förberedelser
- Se till att det finns gott om celler som är tillgängliga för transfektion (flera miljoner celler för varje DNA ska transfekterade).
- Coat en vävnadskultur maträtt, i vilken transfekterade cellerna kommer att seedas med 10 mikrogram / ml humant fibronektin kvällen innan transfektion. Just innan transfektion protokollet, ta bort fibronektin, skölj skålen med PBS och placera media kultur i skålen. Lämna skålen i 37 ° C vävnadskultur inkubator för att värma media. Även Häll 1 ml av kulturen media i inkubatorn för att förvärma till 37 ° C.
- Placera DNA (er) som skall transfekterade och transfektion lösning (från Amaxa) på is.
Transfektion
- Tvätta ett definierat antal celler med PBS (vi brukar använda ~ 5 x 106 celler per transfektion). Pellets cellerna genom centrifugering (1000 rpm (~ 200xg) i 5 minuter), ta bort så mycket PBS som möjligt, och resuspendera cellpelleten i 100 ìl av transfektion lösning som med transfektion kit. Överför cellsuspension till ett 1,7 ml Eppendorf-rör.
- Tillsätt 5 ìl av DNA (~ 5-10 mikrogram av DNA per transfektion) till cellsuspensionen och blanda försiktigt.
- Använda Amaxa mini-pipett för cell-DNA blanda i Amaxa transfektion kyvetten. Kontrollera att du har 1 ml förvärmda närsubstrat för nästa steg. Dessutom, ta bort cellen skålen med kultur media från inkubatorn och placera den i vävnadsodling huven.
- Placera kyvetten i Nucleofector, rotera hjulet medurs och välj program "A-033". Tryck på Enter.
- En framgångsrik transfektion indikeras av närvaron av ett mycket tätt skikt av bubblor ovanpå lösningen i kyvetten. Tillsätt 500 l varm media i kyvetten, och använda Amaxa mini-pipett de transfekterade cellerna i skålen med förvärmda media. Skölj kyvetten med fler varma media och lägga till skölj till samma maträtt. Placera skålen med cellerna i 37 ° C vävnadskultur inkubator.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver en relativt snabb och effektiv transfektion förfarande för hNSPCs. Med hjälp av denna procedur har vi fått första transfektion effektivitet på ~ 35%. Celler transfekterade genom detta förfarande kan användas för korttidsstudier (övergående transfekterade celler) eller för långsiktiga studier om ett urval medel används för att generera ett stabilt transfekterade befolkning. Vi har genererat stabilt transfekterade celler där ~ 70% av cellerna uttrycker exogent protein. I övergående transfekterade hNSPCs har vi observerade fortsatt uttryck av exogent protein för ~ 7 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Författarna vill tacka för Dr Philip H. Schwartz av den nationella människorättskommissionen Neural Stem Cell Resurs på Barnens s Hospital, Orange County Forskningscentralen för att ge hNSPC kulturer.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| The Nucleofector Device | Tool | Amaxa | AAD-1001 | |
| Mouse neural stem cell nucleofector kit | Reagent | Amaxa | VPG-1004 |
References
- Gresch, O., Engel, F. B., Nesic, D., Tran, T. T., England, H. M., Hickman, E. S., Krner, I., Gan, L., Chen, S., Castro-Obregon, S., Hammermann, R., Wolf, J., M ller-Hartmann, H., Nix, M., Siebenkotten, G., Kraus, G., Lun, K. New non-viral method for gene transfer into primary cells. Methods. 33, 151-163 (2004).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Passaging Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=263 (2007).
- Marchenko, S., Flanagan, L. A. Counting Human Neural Stem Cells. Journal of Visualized Experiments. 7, http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=262 (2007).
