Summary
Wir berichten Entwicklung einer negativen Auslese-System in
Abstract
Entamoeba histolytica ist der Erreger der Amöbiasis und infiziert von bis zu 10% der Weltbevölkerung. Die molekulare Techniken, die die Up-und Down-Regulation der Genexpression aktiviert haben verlassen sich auf die Transfektion von Plasmiden stabil aufrechterhalten. Während diese unser Verständnis von Entamoeba Virulenzfaktoren erhöht haben, um die Kapazität exogener DNA in Genom, die es erlauben reversen Genetik Experimente, würde einen erheblichen Vorteil in der Studie von diesem Parasiten wäre zu integrieren. Die Herausforderungen durch diesen Organismus besprochen werden, Unfähigkeit, für die homologe Rekombination Ereignisse und Schwierigkeiten zu episomalen Plasmid-DNA aus transfizierten Trophozoiten Heilung zu wählen. Die späteren Ergebnisse in einem hohen Hintergrund exogener DNA, ein großes Problem bei der Identifizierung von Trophozoiten, in dem eine bona fide genomische Integration Ereignis eingetreten ist. Wir berichten über die Entwicklung einer negativen Auslese-System auf transgene Expression einer Hefe Cytosindeaminase und Uracil Phosphoribosyltransferase Chimäre (FCU1) und die Auswahl mit Prodrug 5-Fluorocytosin (5-FC) basiert. Die FCU1 Enzym wandelt ungiftig 5-FC in toxischen 5-Fluorouracil und 5-Fluoruridin-5'-monophosphat. E. histolytica Linien auszudrücken FCU1 wurde festgestellt, dass 30-fach empfindlicher auf das Pro-Pharmakon im Vergleich zur Kontrollgruppe Belastung werden.
Protocol
1. FCU Negative Selection System in Entamoeba histolytica
- Der Vektor Steuerleitung (HM1 / pKT3M) und die experimentelle Linie (HM1/pKT3M-FCU1) wurden von bisher beschriebenen Techniken 1,2 erzeugt. Seed die Linien unter-Studie aus dem Bestand Röhren in T-25 Flaschen und pflegen Auswahl durch Zugabe geeigneter Antibiotika (12 ug / mL G418) in TYI-S-33 3 Medium. Die Flaschen sollten 70-80% konfluent nach 16-18 Stunden Wachstum bei 37 ° C.
- Bereiten Sie einen frischen 50 mM Stammlösung von 5-Fluorocytosin (5-FC, Sigma) in warmen TYI-S-33 Medium. Vortex konsequent für einige Minuten auf 5-FC vollständig aufzulösen. Filter-Sterilisation der Stammlösung, indem es durch ein 0,22 um-Filter.
- Ernte Trophozoiten, indem die Flaschen auf Eis für 3-5 Minuten und das Sammeln der Zellen durch Zentrifugation bei 200xg für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Das Pellet in frischem Medium TYI und zählen Sie die Zellen.
- Aufbau eines typischen Experiments verwendet 0,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung einer 48-Well-Platte in einem Gesamtvolumen von 1 mL und dreifach wiederholt und für jede Prüfbedingung. Darüber hinaus erleichtert Fluoreszenz-Messungen, ist eine separate Platte für jeden Stamm pro Zeitpunkt verwendet.
- Seed 0,5 x 10 4 Zellen pro Vertiefung für jeden Test 5-FC-Konzentration in dreifacher Ausfertigung. Pflegen Sie die Antibiotika-Selektion Druck in der TYI Medium. Nun fügen Sie die erforderliche Menge von 5-FC-Stammlösung und Trophozoiten in jede Vertiefung.
- Die Inkubation in einer anaeroben Beutel bei 37 ° C.
2. Bestimmung der Auswahl Efficiency
- Bereiten Sie 2 mg / ml Stammlösung von Cell-Tracker grünen CMFDA (Invitrogen) in DMSO. Um die Arbeit zu verdünnen das Lager 1000-fach in serum-freiem Medium TYI.
- Entfernen Sie das Medium vollständig von Trophozoiten Kulturplatten und ersetzen mit 150 ul serumfreiem TYI mit CMFDA. Weiter Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Entfernen Sie die Farbstofflösung aus Brunnen und lesen Sie die Platte in der Spectramax M2 Mikroplatten Spektrofluorometer. Die Anregungswellenlänge sollte bei 492 nm eingestellt werden und die Fluoreszenzemission bei 517 nm gelesen.
- Vergleichen Sie die Fluoreszenz-Werte für die Kontroll-Zellen im Vergleich zu den Test-Transfektanten.
- Lesen Sie weiter die Platten bei jedem Zeitintervall. Verwenden Sie geeignete positive (TYI nur) und negativen (25 ug / mL Hygromycin) Kontrollvertiefungen in jeder Platte.
3. Repräsentative Ergebnisse
Die E. histolytica Transfektanten zeigten robust Ausdruck Codon optimiert rekombinanten FCU1 (Abbildung 1). Wenn dieses Protokoll korrekt ist es Ergebnisse in selektiven Eliminierung von E. gefolgt histolytica exprimieren FCU1 in Gegenwart von 0,5 mM 5-Fluorocytosin. Control-Zellen, im Gegensatz normal weiter wachsen bis zu 5 mM Konzentration von 5-FC und erreichen Zusammenfluss zwischen 72 und 96 Uhr (Abb. 2-a). Die FCU1 tragenden Zellen in 48 Stunden vollständig lysiert, wenn die behandelte Brunnen unter einem Mikroskop betrachtet werden. Diese auch verringerte Fluoreszenz zeigen, wenn mit den vitalen Farbstoff CMFDA, die in quantitative Studien, bei denen große Anzahl von Proben (Abb. 2-b) verwendet wird gefärbt. Die FCU1/5-FC System ist ein effektives und leistungsfähiges Werkzeug für die negative Selektion E. histolytica Trophozoiten.
Abbildung 1. Generierung von E. histolytica HM1 Transfektanten, die negativen Selektionsmarker
(A) FCU1 rekombinante Protein wurde auf einem Western-Blot mit anti-c Myc-Antikörper (oben) erkannt. Wie erwartet, konnte ein 42kDa-Band erkannt (dargestellt durch einen Pfeil) an der gesamten Lysat aus der FCU-Transfektanten, aber nicht in dem Vektor allein Steuerung Transfektanten. Der untere Teil zeigt den gleichen Blot sondiert mit anti-Aktin-Antikörper als Ladekontrolle. (B) Ergebnisse der quantitativen real time PCR zeigen Ausdruck FCU1 spezifische mRNA normiert auf lgl4 Kontrolle.
Abbildung 2. In-vitro-Empfindlichkeit gegenüber Medikamenten von E. histolytica Transfektanten, die negativen Selektionsmarker
Überlebenskurven von (a) Steuerung Transfektanten und (b) FCU1 Ausdruck Transfektanten in 48-Well-Platte kultiviert. Die Zellen wurden in Anwesenheit von steigenden Konzentrationen von gewachsenen das Pro-Pharmakon-5-Fluorocytosin; das Überleben der Zelle wurde durch CMFDA Färbung in jedem Zeitintervall quantifiziert werden, da auf der X-Achse bezeichnet. Die Y-Achse repräsentiert Fluoreszenz-Einheiten und ist ein direktes Spiegelbild der überlebenden Zellpopulation. Bitte beachten Sie, dass die FCU1 Ausdruck Transfektanten signifikante Sensibilität zeigte bei 0,5 mM Prodrug-Konzentration im Vergleich zur Kontrollgruppe. Keine Zellen wurden bei 120h Zeitpunkt in dieser Brunnen als com beobachtetVergleich zum konfluenten Wachstum in den entsprechenden Kontroll-Wells unter dem Mikroskop (Daten nicht gezeigt). Hygro bezeichnet 25 Mirkogramm / ml Hygromycin als negative Kontrolle verwendet.
Discussion
Obwohl es erhebliche Fortschritte in der Entamoeba molekularbiologische Werkzeuge wurden gibt es keine aktuellen Methoden zur Verfügung, zu löschen oder zu stören Gene 4. Knockdown von Gen-Expression wurde durch die Verwendung von Haarnadel RNAs 5, small interfering RNA 6 wurde erreicht und bakteriell exprimierten dsRNA 7. Allerdings sind diese Methoden während mit Wirkung für die jeweiligen Zielgene, haben mehrere Einschränkungen, einschließlich der Verwendung von teuren Chemikalien, kontinuierliche Selektion gegen Antibiotika und die Notwendigkeit einer ständigen Überprüfung durch die hohe Inzidenz der Reversion Laufe der Zeit auftreten (Alicia Linford, persönliche Mitteilung) 8.
Jede Plasmid kann in Entamoeba replizieren, da es offenbar keine strikte Reihenfolge Voraussetzung für Herkunft der DNA-Replikation 9, und so einmal transfiziert, ist es meist schwierig, ein Plasmid zu heilen. Dies schränkt die mögliche Verwendung von intakten Plasmiden in Rekombination und Gen-Knockout-Versuchen. Negative Selektionsmarker sind Schlüsselkomponenten von Gen-Targeting-Methoden, wie sie können verwendet werden, um rekombinante Subpopulationen zu beseitigen. Wir haben erfolgreich ein Codon Ausdruck optimiert FCU1 Gen in Entamoeba histolytica und getestet sein Potenzial als negative Selektionsmarker. Dieser Gen-Fusion hat für Suizid-Gen-Therapie von humanen Tumorzellen eingesetzt und metabolisiert das Prodrug 5-FC in giftige Folgeprodukte was zu einer Hemmung der RNA-und DNA-Synthese 10. FCU1 wurde vor kurzem als eine negative Selektionsmarker in Plasmodium, ein weiteres einzelligen Parasiten verwendet. Plasmodium berghei exprimieren FCU1 gefunden wurden, werden fast 1000-fach empfindlicher auf das Pro-Pharmakon in vitro und in vivo Behandlung mit 5-FC starben mehr als 99,9% der infizieren rekombinanten Parasiten in die Erythrozyten-Stufen-Maus-Modell der Malaria 11. E. histolytica exprimieren FCU1 zeigten nur eine 30-fach erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Prodrug 5-FC im Gegensatz zu der Empfindlichkeit in P. beobachtet berghei. Mögliche Gründe dafür könnten großen Pool von Nukleotiden in das Nährmedium im Wettbewerb mit den toxischen Metaboliten werden.
In beiden P. berghei und P. falciparum die FCU1 Marker in gezielten Gen-Unterbrechung verwendet wurde. Studien 11,12. Wir wollen die Entamoeba-Genom durch homologe Rekombination zu manipulieren. Die Validierung der FCU1/5-FC negative Selektion ist ein wichtiger Schritt in Richtung dieses Ziels.
Disclosures
Die Produktion dieses Video wurde von Sigma Aldrich, Inc., die einige der Reagenzien in diesem Artikel verwendet produziert gesponsert.
Acknowledgments
Wir möchten Dr. Philippe Erbs, die uns mit der Reihenfolge der FCU1 Gen danken. Diese Arbeit wurde vom NIH AI 26649 unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | |
| 5-Fluorocytosine | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
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