Summary
אנו מדווחים על פיתוח של מערכת בחירה שלילית
Abstract
Entamoeba histolytica הוא סוכן סיבתי של amebiasis ומדביק עד 10% מאוכלוסיית העולם. בטכניקות מולקולריות אפשרו למעלה ולמטה ויסות של ביטוי גנים להסתמך על transfection של פלסמידים נשמר ביציבות. בעוד אלה הגדילו את ההבנה שלנו של גורמים Entamoeba ארסיות, היכולת לשלב את ה-DNA אקסוגני לתוך הגנום, אשר תאפשר להפוך ניסויים גנטיקה, יהיה יתרון משמעותי במחקר של טפיל זה. האתגרים שהוצגו על ידי אורגניזם זה כוללים חוסר יכולת לבחור עבור הומולוגיים אירועי רקומבינציה וקושי לרפא DNA פלסמיד episomal מ trophozoites transfected. התוצאות מאוחר יותר ברקע גבוהה של DNA אקסוגני, בעיה מרכזית בזיהוי של trophozoites שבו אירוע בתום לב אינטגרציה הגנומי התרחשה. אנו מדווחים על פיתוח של מערכת המבוססת על סלקציה שלילית ביטוי מהונדס של דאמינז שמרים ציטוזין אורציל transferase phosphoribosyl הכימרה (FCU1) ובחירת עם prodrug 5-fluorocytosine (5-FC). האנזים ממיר FCU1 רעיל 5-FC לתוך fluorouracil-5 רעילים 5-fluorouridine-5'-monophosphate. E. קווי histolytica להביע FCU1 נמצאו 30 לקפל רגישים יותר prodrug לעומת זן הביקורת.
Protocol
1. FCU מערכת סלקציה שלילית ב Entamoeba histolytica
- בקרת וקטור קו (HM1 / pKT3M) ואת קו ניסיוני (HM1/pKT3M-FCU1) נוצרו על ידי 1,2 הטכניקות המתוארות קודם לכן. זרעים הקווים תחת מחקר מן המניות לתוך צינורות T-25 צלוחיות ולשמור הבחירה על ידי הוספת אנטיביוטיקה המתאימה (12 מיקרוגרם / מ"ל G418) בינוני 3 TYI-S-33. צלוחיות צריך להיות 70-80% ומחוברות לאחר 16-18 שעות של צמיחה ב 37 ° C.
- הכן פתרון טרי המניות של 5-50mm Fluorocytosine (5-FC, Sigma) במדיום TYI-S-33 חם. וורטקס בקפדנות במשך מספר דקות לפרק 5-FC לחלוטין. מסנן לעקר את הפתרון המניות על ידי העברתו דרך מסנן 0.22 מיקרומטר.
- קציר trophozoites ידי הצבת צלוחיות על קרח למשך 3-5 דקות לאסוף את התאים על ידי centrifuging ב 200xg במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. Resuspend גלולה במדיום TYI טריים לספור את התאים.
- עיצוב של ניסוי טיפוסי משתמשת 0.5 x 10 4 תאים לכל גם צלחת 48 באר נפח סופי של 1 מ"ל, וחוזר בשלושה עותקים עבור כל תנאי הבדיקה. בנוסף, כדי להקל על המדידות ניאון, צלחת נפרדת משמש עבור כל זן לכל נקודת זמן.
- 0.5 Seed x 10 4 תאים לכל טוב עבור כל בדיקה 5-FC ריכוז, בשלושה עותקים. שמירה על לחץ ברירה אנטיביוטי במדיום TYI. עכשיו להוסיף את הכמות הנדרשת של פתרון FC-5 המניות trophozoites היטב כל אחד.
- דגירה צלחות בתיק אנאירובי על 37 ° C.
2. קביעת יעילות לבחירה
- הכן 2 מ"ג / מ"ל פתרון המניות של תא גשש ירוק CMFDA (Invitrogen) ב DMSO. כדי להפוך את הפתרון עובד לדלל את המניות של פי 1000 בינוני TYI בסרום חינם.
- הסר את בינוני לחלוטין צלחות תרבות trophozoite ולהחליף 150 CMFDA μL TYI סרום ללא המכיל. המשך דגירה על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1.
- הסר את הפתרון לצבוע מבארות ולקרוא את הצלחת spectrofluorometer M2 microplate Spectramax. גל עירור צריך להיות מוגדר ב 492 ננומטר ואת פליטת הקרינה לקרוא 517 ננומטר.
- השווה את ערכי הקרינה עבור התאים מלאה מול transfectants הבדיקה.
- המשך לקרוא את הלוחות במרווח בכל פעם. שימוש חיובי המתאים (TYI בלבד) והשלילי (25 מיקרוגרם / מ"ל hygromycin) בארות שליטה כל צלחת.
3. נציג תוצאות
E. transfectants histolytica הראו ביטוי חזק של FCU1 קודון רקומביננטי אופטימיזציה (איור 1). כאשר פרוטוקול זה הוא לאחר נכונה התוצאה היא חיסול סלקטיבי של E. histolytica תאים להביע FCU1 בנוכחות מ"מ 0.5 5 fluorocytosine. תאים הבקרה, בניגוד להמשיך לצמוח בדרך כלל במהירות של עד 5 מ"מ בריכוז של 5-FC ולהגיע מפגש בין 72 לבין 96 שעות (איור 2). FCU1 התאים נושאת ב 48 שעות הם lysed לחלוטין כאשר בארות מטופלים הם מתחת למיקרוסקופ. אלה גם להראות ירידה הקרינה כאשר מוכתמות חיוני לצבוע CMFDA, המשמש במחקרים כמותיים מעורבים מספר גדול של דגימות (תמונה 2 ב). מערכת FCU1/5-FC היא כלי אפקטיבי ורב עוצמה סלקציה שלילית עבור E. histolytica trophozoites.
באיור 1. הדור של E. histolytica HM1 transfectants להביע סמן לבחירה שלילית
(א) חלבון רקומביננטי FCU1 זוהה על כתם המערבי באמצעות נוגדן אנטי-c myc (הפאנל העליון). כצפוי, הלהקה 42kDa ניתן היה לזהות (המוצג על ידי החץ) ב lysate הכולל מן transfectants FCU אך לא וקטור לבד transfectants שליטה. הפאנל התחתון מראה את אותו כתם נחקר עם נוגדן אנטי אקטין כביקורת הטעינה. (ב) תוצאות של זמן אמת כמותי PCR מראה ביטוי של mRNA FCU1 ספציפי מנורמל לשלוט lgl4.
2. איור במבחנה התרופה הרגישות של E. histolytica transfectants להביע סמן לבחירה שלילית
הישרדות של עקומות (א) transfectants מלאה (ב) transfectants FCU1 להביע בתרבית בצלחת 48-היטב. התאים גדלו בנוכחות ריכוזים הגוברת של prodrug-5-fluorocytosine; הישרדות התא היה לכמת ידי מכתים CMFDA במרווח כל הזמן מסומן על ציר ה-X. ציר Y מייצג יחידות פלואורסצנטי הוא השתקפות ישירה של האוכלוסייה התא לשרוד. שים לב FCU1 transfectants להביע הראו רגישות משמעותית בריכוז prodrug 0.5mm לעומת שליטה. תאים לא נצפו בנקודת זמן 120h אלה בארות כמו compared לצמיחה ומחוברות לראות את הבארות בקרה המתאימים תחת מיקרוסקופ (מידע לא מוצג). Hygro מציין 25μg / mL hygromycin לשמש מלאה שלילי.
Discussion
אמנם יש כבר התקדמות ניכרת כלים Entamoeba ביולוגי מולקולרי אין השיטות הקיימות זמין למחוק או לשבש גנים 4. מציאה של ביטוי גנים ספציפיים הושג על ידי שימוש RNAs מכבנה 5, קטן מפריע RNA 6 והביע bacterially dsRNA 7. אולם שיטות אלו תוך יעיל עבור גני מטרה בהתאמה, יש מספר מגבלות, כולל שימוש בכימיקלים יקרים, מבחר מתמשך נגד אנטיביוטיקה את הצורך באימות מתמדת עקב שכיחות גבוהה של חזרה המתרחשים לאורך זמן (אלישיה Linford, תקשורת אישית) 8.
הפלסמיד כל יכול לשכפל Entamoeba כפי שיש כנראה לא דרישה רצף קפדנית על מקורותיה של שכפול הדנ"א 9, transfected כך פעם, זה בדרך כלל קשה לרפא פלסמיד. זה מגביל את השימוש האפשרי של פלסמידים שלמים בניסויים רקומבינציה ואת הגן בנוקאאוט. סמני סלקציה שלילית הם רכיבי מפתח של גן מיקוד שיטות כפי שהם יכולים לשמש כדי לחסל subpopulations רקומביננטי. אנחנו הבענו בהצלחה קודון אופטימיזציה FCU1 גנים Entamoeba histolytica נבדק הפוטנציאל שלה כסמן לבחירה שלילית. היתוך גן זה שימש לטיפול גן התאבדות של תאים סרטניים אנושיים חילוף החומרים prodrug 5-FC למוצרים במורד רעילים וכתוצאה מכך עיכוב סינתזה של RNA-DNA 10. FCU1 שימש לאחרונה כסמן לבחירה שלילית Plasmodium, עוד טפיל protozoan. Plasmodium תאים berghei להביע FCU1 נמצאו 1000 כמעט פי רגישים יותר prodrug במבחנה טיפול vivo עם 5-FC נהרגו מעל 99.9% של הדבקה של טפילים רקומביננטי במודל האריתרוציטים בשלב העכבר של מלריה 11. E. תאים histolytica להביע FCU1 הראו רק רגישות פי 30 עלה ל prodrug 5-FC בניגוד רגישות שנצפתה פ berghei. הסיבות האפשריות לכך יכולה להיות מאגר גדול של נוקלאוטידים הזמינים בינוני הצמיחה מתחרים עם מטבוליטים רעילים.
בשני פ berghei ו פ falciparum סמן FCU1 נעשה שימוש שיבוש גנטי ממוקד. מחקרים 11,12. אנו שואפים לשנות את הגנום Entamoeba באמצעות הומולוגיים רקומבינציה. אימות של מערכת מבחר FCU1/5-FC השלילי הוא צעד משמעותי לקראת המטרה הזאת.
Disclosures
ההפקה של הוידאו הזה מומן על ידי חברת סיגמא אלדריץ', Inc, אשר מייצרת כמה חומרים כימיים המשמשים במאמר זה.
Acknowledgments
ברצוננו להודות לד"ר Erbs פיליפ לספק לנו את הרצף של הגן FCU1. עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענק AI 26649.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | |
| 5-Fluorocytosine | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
- Olvera, A. Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection. Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).
- Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Clark, C. Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).
- Linford, A. S. Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica. BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).
- Solis, C. F., Guillén, N. Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).
- Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression. PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).
- MacFarlane, R. C., Singh, U. Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis. Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).
- Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica. J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).
- Erbs, P. In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).
- Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium. Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).
- Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).
