Summary
Riportiamo lo sviluppo di un sistema di selezione negativa
Abstract
Entamoeba histolytica è l'agente eziologico di amebiasi e infetta fino al 10% della popolazione mondiale. Le tecniche molecolari che hanno permesso l'up-e down-regolazione dell'espressione genica contare sulla trasfezione di plasmidi stabilmente mantenuta. Anche se questi hanno aumentato la nostra comprensione dei fattori di virulenza Entamoeba, la capacità di integrare DNA esogeno nel genoma, che consentirebbe invertire esperimenti di genetica, sarebbe un vantaggio significativo nello studio di questo parassita. Le sfide presentate da questo organismo comprendono incapacità di selezionare, per eventi di ricombinazione omologa e la difficoltà di curare episomiale DNA plasmidico da trofozoiti transfettate. I risultati più avanti in un contesto alto di DNA esogeno, un grave problema per l'identificazione di trofozoiti in cui un evento bona fide integrazione genomica si è verificato. Riportiamo lo sviluppo di un sistema di selezione basato sulla negativo espressione transgenica di una citosina deaminasi lievito e uracile fosforibosil transferasi chimera (FCU1) e selezione con profarmaco 5-fluorocytosine (5-FC). L'enzima converte FCU1 non tossico 5-FC in tossico 5-fluorouracile e 5-fluorouridina-5'-monofosfato. E. Linee che esprimono histolytica FCU1 sono risultati essere 30 volte più sensibile alla profarmaco rispetto al ceppo di controllo.
Protocol
1. FCU sistema di selezione negativa in Entamoeba histolytica
- La linea di controllo vettoriale (HM1 / pKT3M) e la linea sperimentale (HM1/pKT3M-FCU1) sono stati generati da 1,2 tecniche descritte in precedenza. Seed le linee oggetto di studio dai tubi magazzino in T-25 palloni e mantenere la selezione con l'aggiunta di antibiotico appropriato (12 mg / mL G418) in TYI-S-33 3 media. I palloni devono essere del 70-80% confluenti dopo 16-18 ore di crescita a 37 ° C.
- Preparare una soluzione fresca magazzino 50mM di 5-fluorocytosine (5-FC, Sigma) nel warm TYI-S-33 di media. Vortex rigorosamente per alcuni minuti per sciogliere 5-FC completamente. Filtro-sterilizzare la soluzione madre facendola passare attraverso un filtro di 0,22 micron.
- Trofozoiti raccolta mettendo i palloni in ghiaccio per 3-5 minuti e raccogliere le cellule per centrifugazione a 200xg per 5 minuti a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in acqua dolce di media TYI e contare le cellule.
- Progettazione di un tipico esperimento utilizza 0,5 x 10 4 cellule per pozzetto di una piastra da 48 pozzetti in un volume finale di 1 ml; e ripete tripla per ogni condizione di test. Inoltre, per facilitare le misurazioni fluorescente, un piatto a parte è usata per ogni ceppo per ogni punto del tempo.
- Semi di 0,5 x 10 4 cellule per pozzetto per ogni prova 5-FC concentrazione, in triplice copia. Mantenere la pressione antibiotica selezione nel medio TYI. Ora aggiungete la quantità necessaria di 5-FC soluzione madre e trofozoiti in ciascun pozzetto.
- Incubare le piastre in un sacchetto anaerobica a 37 ° C.
2. Determinazione della efficienza di selezione
- Preparare 2 mg / ml soluzione stock di Cell Tracker verde CMFDA (Invitrogen) in DMSO. Per rendere la soluzione di lavoro diluire lo stock di 1000 volte in mezzo privo di siero TYI.
- Rimuovere il supporto completamente da piastre di coltura trofozoite e sostituire con 150 microlitri di siero senza CMFDA TYI contiene. Continua incubazione a 37 ° C per 1 ora.
- Rimuovere la soluzione colorante da pozzi e leggere la piastra nella spettrofluorimetro Spectramax M2 micropiastre. La lunghezza d'onda di eccitazione deve essere impostata a 492 nm e l'emissione di fluorescenza leggere a 517 nm.
- Confrontare i valori di fluorescenza per le cellule di controllo rispetto al trasfettate prova.
- Continua a leggere le piastre a ogni intervallo di tempo. Usa positiva appropriata (TYI solo) e negativi (25 mg / ml Hygromycin) pozzetti di controllo in ogni piatto.
3. Rappresentante Risultati
La E. trasfettate histolytica ha mostrato l'espressione solida di FCU1 codone ottimizzato ricombinante (Figura 1). Quando questo protocollo è seguita correttamente il risultato è l'eliminazione selettiva di E. cellule che esprimono histolytica FCU1 in presenza di 0,5 mM 5-fluorocytosine. Cellule di controllo, al contrario continuano a crescere normalmente fino a 5 mM concentrazione di 5-FC e raggiungere la confluenza tra il 72 e 96 ore (Figura 2-a). Il FCU1 cellule portando a 48 ore sono completamente lisati, quando i pozzi trattati sono visti al microscopio. Questi mostrano anche diminuito fluorescenza quando colorati con il colorante vitale CMFDA, che viene utilizzato negli studi quantitativi che coinvolgono gran numero di campioni (figura 2-b). Il sistema FCU1/5-FC è uno strumento efficace e potente selezione negativa per E. histolytica trofozoiti.
Figura 1. Generazione di E. histolytica HM1 trasfettate che esprimono negativo marcatore
(A) FCU1 proteina ricombinante è stato rilevato su un Western Blot con anticorpi anti-c Myc (pannello superiore). Come previsto, una band 42kDa poteva essere individuato (indicato da una freccia) nel lisato totale dal trasfettate FCU, ma non nel vettore solo trasfettate controllo. Il pannello in basso mostra la macchia stessa sondato con l'anticorpo contro l'actina come controllo di caricamento. (B) I risultati della PCR in tempo reale quantitativo mostrando FCU1 espressione di mRNA specifico normalizzato a lgl4 controllo.
Figura 2. Sensibilità ai farmaci in vitro di E. trasfettate histolytica esprimendo negativo marcatore
Curve di sopravvivenza di (a) trasfettate controllo e (b) trasfettate FCU1 esprimere coltivate in 48 pozzetti. Le cellule sono state coltivate in presenza di concentrazioni crescenti del profarmaco-5-fluorocytosine; la sopravvivenza delle cellule è stata quantificata colorazione CMFDA ad ogni intervallo di tempo indicato sulla X-asse. L'asse Y rappresenta unità fluorescenza ed è un riflesso diretto della popolazione di cellule sopravvissute. Si prega di notare che la FCU1 trasfettate che esprimono mostrato sensibilità significativa a concentrazione profarmaco 0,5 mm rispetto al controllo. Le cellule non sono stati osservati a punto temporale 120h in questi pozzi come comconfrontato alla crescita confluente visto in pozzetti di controllo corrispondente al microscopio (dati non riportati). Hygro denota 25μg / mL Hygromycin utilizzato come controllo negativo.
Discussion
Anche se ci sono stati progressi sostanziali in Entamoeba strumenti molecolari biologici non esistono metodi attualmente disponibili per eliminare o interrompere geni 4. Knockdown di espressione genica specifici è stato raggiunto con l'uso di RNA a gomito 5, piccoli RNA interferenti 6 e batteri espresso dsRNA 7. Tuttavia questi metodi efficaci, mentre per i geni bersaglio rispettivi, hanno diverse limitazioni compreso l'uso di prodotti chimici costosi, selezione continua contro gli antibiotici e la necessità per la convalida costante a causa della elevata incidenza di ritorno che si verificano nel tempo (Alicia Linford, comunicazione personale) 8.
Ogni plasmide può replicare in Entamoeba come non c'è a quanto pare un requisito sequenza rigorosa delle origini di replicazione del DNA 9 e così una volta transfettate, di solito è difficile da curare un plasmide. Questo limita la possibilità di usare i plasmidi intatto negli esperimenti di knockout e ricombinazione genica. Marcatori di selezione negativa sono i componenti chiave del gene targeting metodi possono essere utilizzati per eliminare le sottopopolazioni ricombinante. Abbiamo espresso con successo un codone ottimizzato FCU1 gene in Entamoeba histolytica e testato le sue potenzialità come marcatore negativo selezionabile. Questo gene di fusione è stato utilizzato per la terapia genica suicidio delle cellule tumorali umane e metabolizza il profarmaco 5-FC in tossici prodotti a valle con conseguente inibizione della sintesi del DNA e RNA 10. FCU1 è stato recentemente utilizzato come marcatore negativo selezionabile in Plasmodium, un protozoo parassita. Plasmodium cellule che esprimono berghei FCU1 sono risultati essere quasi 1000 volte più sensibili al pro-farmaco in vitro e in vivo, il trattamento con 5-FC ha ucciso oltre il 99,9% del infettare i parassiti ricombinante nella fase eritrocitaria modello murino della malaria 11. E. cellule che esprimono histolytica FCU1 hanno mostrato solo un 30-volte maggiore sensibilità al profarmaco 5-FC in contrasto con la sensibilità osservata in P. berghei. I motivi possibili di questo potrebbe essere grande piscina di nucleotidi disponibili nel terreno di coltura in competizione con i metaboliti tossici.
In entrambi i P. berghei e P. falciparum il marcatore FCU1 è stato utilizzato in rottura genica mirata. studi 11,12. Il nostro obiettivo è di manipolare il genoma Entamoeba utilizzando la ricombinazione omologa. La validazione del sistema FCU1/5-FC selezione negativa è un passo significativo verso questo obiettivo.
Disclosures
La produzione di questo video è stato sponsorizzato da Sigma Aldrich, Inc., che produce alcuni dei reagenti utilizzati in questo articolo.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare il Dott. Philippe Erbs per averci fornito la sequenza delle FCU1 genica. Questo lavoro è stato sostenuto da NIH concedere AI 26649.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | |
| 5-Fluorocytosine | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
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