Summary
Мы сообщаем о развитии отрицательной системы отбора в
Abstract
Entamoeba histolytica является возбудитель амебиаза и заражает до 10% населения мира. Молекулярных методов, которые позволили вверх и вниз регуляции экспрессии генов полагаться на трансфекции стабильно поддерживается плазмид. Хотя эти увеличили наше понимание факторов вирулентности Entamoeba, потенциала для интеграции экзогенной ДНК в геном, который позволил бы обратный экспериментов генетики, было бы значительное преимущество в изучении этого паразита. Проблем, возникающих в этом организме включают неспособность выбрать для гомологичной рекомбинации и трудности вылечить эписомной плазмидной ДНК из трансфицированных трофозоиты. Поздно приводит к высокой фоне экзогенной ДНК, главная проблема в идентификации трофозоиты, в которой добросовестные геномной событием интеграции не произошло. Мы сообщаем о развитии отрицательной системы отбора, основанного на трансгенных выражение дезаминазы дрожжей цитозин и урацил фосфорибозил трансферазы химера (FCU1) и выделение пролекарством 5-fluorocytosine (5-FC). Фермент FCU1 преобразует нетоксичные 5-FC в токсичные 5-фторурацила и 5-фторуридин-5'-монофосфат. E. histolytica линии, экспрессирующие FCU1 оказались в 30 раз более чувствительной к пролекарство по сравнению с контролем напряжения.
Protocol
1. FCU Отрицательные Выбор системы в Entamoeba histolytica
- Линии векторного управления (HM1 / pKT3M) и экспериментальной линии (HM1/pKT3M-FCU1) были сгенерированы ранее описанных 1,2 техник. Семенной линий при исследовании со склада трубы в Т-25 колб и поддерживать выбор, добавив соответствующий антибиотик (12 мкг / мл G418) в Tyi-S-33, 3 средних. Колбы должна быть 70-80% сливной после 16-18 часов роста при 37 ° C.
- Подготовка свежей 50 мМ маточного раствора из 5-Fluorocytosine (5-FC, Sigma) в теплой Tyi-S-33 среды. Vortex строго в течение нескольких минут, чтобы растворить 5-ФК полностью. Фильтр-стерилизовать маточного раствора, пропуская ее через фильтр 0,22 мкм.
- Урожай трофозоиты путем размещения колбы на льду в течение 3-5 минут и сбора клетки центрифугированием при 200xg в течение 5 минут при комнатной температуре. Ресуспендируют пеллет в свежую среду Tyi и считать клетки.
- Дизайн типичном эксперименте используется 0,5 х 10 4 клеток на лунку 48-луночного планшета в конечном объеме 1 мл, и трижды повторяется для каждого теста состоянии. Кроме того, для облегчения флуоресцентных измерений, отдельная пластина используется для каждого штамма на момент времени.
- Семенной 0,5 х 10 4 клеток на лунку для каждого теста 5-ФК концентрации, в трех экземплярах. Поддержание давления отбора антибиотика в среде Tyi. Теперь добавьте необходимое количество 5-ФК маточного раствора и трофозоиты в каждую лунку.
- Инкубируйте пластин в анаэробных мешок при температуре 37 ° C.
2. Определение эффективности выбора
- Подготовка 2 мг / мл исходного раствора сотовый трекера зеленые CMFDA (Invitrogen) в ДМСО. Чтобы сделать рабочий раствор разбавить акции в 1000 раз в бессывороточной среде Tyi.
- Удалить среду полностью из трофозоит пластин культуры и заменить 150 мкл бессывороточной Tyi содержащие CMFDA. Продолжить инкубации при температуре 37 ° С в течение 1 часа.
- Удалить раствор красителя из колодцев и читать пластины в spectrofluorometer Spectramax М2 планшет. Длины волны возбуждения должна быть установлена на 492 нм и флуоресценции выбросов читать на 517 нм.
- Сравните флуоресценции значения для контрольных клеток по сравнению с тест трансфектантов.
- Продолжить чтение пластин на каждом временном интервале. Используйте соответствующие положительные (Tyi только) и отрицательные (25 мкг / мл гигромицину) контроль скважин в каждую тарелку.
3. Представитель Результаты
E. histolytica трансфектантов показал надежную выражение кодон оптимизированы рекомбинантный FCU1 (рис. 1). При этом протоколе следует правильно это приводит к селективной ликвидации Е. histolytica клеток, экспрессирующих FCU1 в присутствии 0,5 мМ 5-fluorocytosine. Управление клетки, в отличие продолжают нормально расти со скоростью до 5 мМ концентрация 5-ФК и достичь слияния между 72 и 96 часов (рис. 2-а). FCU1 проведения клеток на 48 часов полностью лизируются при обработанных скважин рассматриваются под микроскопом. Они также показывают, снизилась флуоресценции при окраске жизненно красителя CMFDA, который используется в количественных исследований с участием большого количества образцов (рис. 2-б). FCU1/5-FC система эффективный и мощный отрицательный выбор инструмента для E. histolytica трофозоиты.
Рисунок 1. Генерация Е. histolytica HM1 трансфектантов выражения отрицательных селективного маркера
() FCU1 рекомбинантный белок был обнаружен на западном пятно с использованием анти-Myc с антителом (верхняя часть). Как и ожидалось, 42kDa группа могла быть обнаружена (показан стрелкой) в общем лизат из трансфектантов FCU, но не в один вектор управления трансфектантов. Нижняя панель показывает то же самое пятно исследовали с антителами анти актина в качестве управления загрузкой. (Б) Результаты количественной ПЦР в реальном времени показывает выражение FCU1 конкретные мРНК нормированная на lgl4 контроля.
Рисунок 2. Экстракорпоральное лекарственной чувствительности Е. histolytica трансфектантов выражения отрицательных селективного маркера
Кривые выживаемости (а) контроль трансфектантов и (б) FCU1 выражения трансфектантов культивировали в 48-луночного планшета. Клетки, выращенные в присутствии увеличивающихся концентраций пролекарство-5-fluorocytosine; выживаемость клеток была количественно окрашиванием CMFDA на каждом временном интервале, как обозначается на оси абсцисс. Y-ось представляет флуоресценции единиц и является прямым отражением выживания клеточной популяции. Обратите внимание, что FCU1 выражения трансфектантов показали значительное чувствительности при концентрации 0,5 пролекарство по сравнению с контролем. Нет клетки были обнаружены в момент времени 120 часов в этих скважинах по сравпо сравнению с сплошной рост видели в соответствующие лунки контроль под микроскопом (данные не приведены). Гигро обозначает 25μg / мл гигромицину использовать в качестве отрицательного контроля.
Discussion
Хотя имели место существенные достижения в области молекулярной биологии Entamoeba инструменты Есть нет доступных методов для удаления или нарушить генов 4. Нокдаун гена конкретное выражение было достигнуто за счет использования шпильки РНК 5, малых интерферирующих РНК 6 и бактериально выразил дсРНК 7. Однако эти методы в то время как в силу для соответствующих генов-мишеней, имеют ряд ограничений в том числе использования дорогостоящих химикатов, непрерывный отбор к антибиотикам и необходимость постоянной проверки в связи с высоким уровнем возврата происходящих с течением времени (Алисия Линфорд, личное сообщение) 8.
Любой плазмиды могут размножаться в Entamoeba как, по-видимому, не является строгим требованием последовательность происхождения репликации ДНК 9, и поэтому, как только трансфекции, как правило, трудно вылечить плазмиды. Это ограничивает возможность использования нетронутой плазмиды в экспериментах рекомбинации генов и нокаутом. Отрицательные маркеры выбора являются ключевыми компонентами генное планирование методов, поскольку они могут быть использованы для устранения рекомбинантный субпопуляций. Мы успешно выразил кодон оптимизированы FCU1 гена в Entamoeba histolytica и испытаны свой потенциал в качестве селективного маркера отрицательная. Этот ген слияния была использована для самоубийства генной терапии опухолевых клеток человека и усваивает пролекарством 5-FC в токсичные продукции глубокой переработки в результате ингибирования РНК и синтез ДНК 10. FCU1 в последнее время использовался в качестве отрицательного селективного маркера в Plasmodium, другой простейшим паразитом. Plasmodium berghei клеток, экспрессирующих FCU1 оказались почти 1000 раз более чувствительны к пролекарство в пробирке и в естественных лечение с 5-ФК погибло более 99,9% заражение рекомбинантный паразитов в эритроцитарной стадии мышиной модели заболевания малярией 11. E. histolytica клеток, экспрессирующих FCU1 показал лишь 30-кратное повышение чувствительности к пролекарством 5-ФК, в отличие от чувствительности наблюдается в P. berghei. Возможными причинами этого могут быть большого пула нуклеотидов доступны в среде роста конкуренции с токсичных метаболитов.
В обоих П. berghei и П. тропической маркер FCU1 была использована в целевых генов разрушения. Исследования 11,12. Мы стремимся манипулировать геномом Entamoeba использованием гомологичной рекомбинации. Проверка FCU1/5-FC отрицательные система отбора является важным шагом на пути к этой цели.
Disclosures
Производство этого видео была организована Sigma Aldrich, Inc, которая производит одни из реагентов, используемых в этой статье.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д-ра Филиппа Эрбс за предоставление нам последовательность FCU1 гена. Эта работа была поддержана NIH грант А. И. 26649.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TYI-S-33 medium | ATCC | Reference included in the text | |
| 5-Fluorocytosine | Sigma-Aldrich | F7129 | |
| Cell tracker green CMFDA | Invitrogen | C2925 | |
| Spectra Max M2 plate-reader | Molecular Devices |
References
- Olvera, A. Stable transfection of Entamoeba histolytica trophozoites by lipofection. Arch. Med. Res. , 49-51 (1997).
- Saito-Nakano, Y., Yasuda, T., Nakada-Tsukui, K., Leippe, M., Nozaki, T. Rab5-associated vacuoles play a unique role in phagocytosis of the enteric protozoan parasite Entamoeba histolytica. J. Biol. Chem. 279, 49497-49507 (2004).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Clark, C. Anaerobic parasitic protozoa : genomics and molecular biology. , Caister Academic. Norfolk UK. (2010).
- Linford, A. S. Short hairpin RNA-mediated knockdown of protein expression in Entamoeba histolytica. BMC Microbiol. 9, 38-38 (2009).
- Solis, C. F., Guillén, N. Silencing genes by RNA interference in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. Methods Mol. Biol. 442, 113-128 (2008).
- Solis, C. F., Santi-Rocca, J., Perdomo, D., Weber, C., Guillén, N. Use of bacterially expressed dsRNA to downregulate Entamoeba histolytica gene expression. PLoS ONE. 4, e8424-e8424 (2009).
- MacFarlane, R. C., Singh, U. Loss of dsRNA-based gene silencing in Entamoeba histolytica: implications for approaches to genetic analysis. Exp. Parasitol. 119, 296-300 (2008).
- Dhar, S. K., Vines, R. R., Bhattacharya, S., Petri, W. A. Ribosomal DNA fragments enhance the stability of transfected DNA in Entamoeba histolytica. J. Eukaryot. Microbiol. 45, 656-660 (1998).
- Erbs, P. In vivo cancer gene therapy by adenovirus-mediated transfer of a bifunctional yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyltransferase fusion gene. Cancer Res. 60, 3813-3822 (2000).
- Braks, J. A. M., Franke-Fayard, B., Kroeze, H., Janse, C. J., Waters, A. P. Development and application of a positive-negative selectable marker system for use in reverse genetics in Plasmodium. Nucleic Acids Res. 34, e39-e39 (2006).
- Maier, A. G., Braks, J. A. M., Waters, A. P., Cowman, A. F. Negative selection using yeast cytosine deaminase/uracil phosphoribosyl transferase in Plasmodium falciparum for targeted gene deletion by double crossover recombination. Mol. Biochem. Parasitol. 150, 118-121 (2006).
