Summary
O ensaio descreve um meio rápido de medir a formação de biofilme no início de bactérias e fungos. Este método utiliza uma placa de microtitulação, como o substrato para formação de biofilme microbiano, e do biofilme é visualizada utilizando cepa cristal violeta. O ensaio fornece tanto um ensaio qualitativo ou quantitativo para a formação de biofilme cedo.
Abstract
Biofilmes são comunidades de micróbios ligados a superfícies, que podem ser encontrados em ambientes médicos, industrial e natural. Na verdade, a vida em um biofilme, provavelmente, representa o modo predominante de crescimento para os micróbios na maioria dos ambientes. Biofilmes maduros têm algumas características distintas. Micróbios biofilme são normalmente cercados por uma matriz extracelular que fornece estrutura e proteção para a comunidade. Micróbios que crescem em um biofilme também têm uma arquitectura característica geralmente compostas por macrocolonies (contendo milhares de células), rodeadas por canais cheios de líquido. Biofilme-grown micróbios também são notórios por sua resistência a uma gama de agentes antimicrobianos, incluindo antibióticos clinicamente relevantes.
O ensaio de microtitulação prato é uma importante ferramenta para o estudo dos estágios iniciais de formação de biofilme, e tem sido aplicado principalmente para o estudo de biofilme bacteriano, embora este ensaio também tem sido usado para estudar a formação de biofilmes de fungos. Porque este ensaio utiliza estática, lote crescimento condições, não permite a formação do biofilme maduro normalmente associados com sistemas de célula de fluxo. No entanto, o ensaio tem sido eficaz na identificação de muitos fatores necessários para o início da formação de biofilme (ie, flagelos, pili, adesinas, enzimas envolvidas na cíclico-di-GMP ligação e metabolismo) e assim como genes envolvidos na produção de polissacarídeo extracelular. Além disso, trabalhos publicados indicam que os biofilmes cultivadas em placas de microtitulação se desenvolvem algumas propriedades de biofilmes maduros, como um antibiótico tolerância e resistência à efetores do sistema imune.
Este ensaio prato simples de microtitulação permite a formação de um biofilme na parede e / ou fundo de um prato de microtitulação. A natureza de alto rendimento do ensaio o torna útil para as telas de genética, bem como a formação de biofilme por cepas de testes múltiplos sob várias condições de cultivo. Variantes deste ensaio foram usadas para avaliar a formação de biofilme inicial para uma ampla variedade de micróbios, incluindo mas não limitado a, pseudomonas, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterococos, micobactérias e fungos.
No protocolo descrito aqui, vamos nos concentrar sobre o uso deste ensaio para estudar a formação de biofilme pelo modelo aeruginosa organismo Pseudomonas. Neste ensaio, a extensão da formação de biofilme é medida usando o corante cristal violeta (CV). No entanto, uma série de outras manchas colorimétrico e metabólicas têm sido relatadas para a quantificação da formação de biofilme utilizando o ensaio de placa de microtitulação. A facilidade, baixo custo e flexibilidade do ensaio de microplaca tornou uma ferramenta fundamental para o estudo de biofilmes.
Protocol
1. O crescimento de um biofilme
- Crescer uma cultura da Pseudomonas aeruginosa do tipo selvagem ou cepa mutante durante a noite em um meio rico (ou seja, LB)
- Diluir a 1:100 cultura durante a noite em meio fresco para ensaios de biofilme. Um meio de ensaio padrão biofilme de P. aeruginosa é M63 meio mínimo suplementado com sulfato de magnésio, glicose e ácidos casamino (ver quadro). Como um biofilme, promovendo alternativas meio que estimula o crescimento menos planctônicas e biofilme mais robusto, a glicose e ácidos casamino pode ser substituída por arginina como o carbono única e fonte de energia.
- Adicionar 100 mL da diluição por poço em um prato de 96 poços. Para ensaios quantitativos, normalmente usam 4-8 poços replicar para cada tratamento.
- Incubar a placa de microtitulação para 4-24 horas a 37 ° C.
2. Coloração do biofilme
- Após a incubação, despejar células girando o prato mais e agitação fora do líquido.
- Delicadamente mergulhe a placa em uma banheira pequena de água (ou seja, use o fundo de caixas de pipeta dica para P1000 pipetmen como a banheira). Sacudir a água. Repita este processo uma segunda vez. Este passo ajuda a remover as células solto e componentes de mídia que pode ser manchada na próxima etapa, e reduz significativamente a coloração de fundo.
- Adicionar 125 mL de uma solução 0,1% de cristal violeta em água para cada poço da placa de microtitulação. Usar luvas e um casaco de laboratório ao fazer a solução. Tenha cuidado ao pesando o CV como o pó é higroscópico e prontamente roupas manchas, pele, etc
- Incubar a microplaca em temperatura ambiente por 10-15 min.
- Lavar o prato 3-4 vezes com água por imersão em uma banheira de água, conforme descrito acima, sacudir e secar vigorosamente sobre uma pilha de toalhas de papel para livrar o prato de todas as células em excesso e corante.
- Ligue a placa de microtitulação de cabeça para baixo e seco por algumas horas ou durante a noite.
- Para ensaios qualitativos, os poços podem ser fotografados quando seco.
3. Quantificação do biofilme
- Adicionar 125 mL de 30% de ácido acético em água a cada poço da placa de microtitulação para solubilizar o CV.
- Incubar a microplaca em temperatura ambiente por 10-15 min.
- Transferência de 125 mL do CV solubilizados a um prato de microtitulação novo fundo plano.
- Quantificar absorbância em leitor de placas a 550 nm usando 30% de ácido acético em água como o branco.
4. Resultados representativos:
Figura 1. Mostra um resultado representativo para ensaios de formação de biofilme realizada para Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens e Staphylococcus aureus. (A) Uma visão do lado do bem com um biofilme de P. aeruginosa (8 horas, 37 ° C). (B) Uma visão do lado do bem com um biofilme de P. fluorescens (6 hrs, 30 ° C). (C) Uma visão top-down do biofilme formado por S. aureus em uma placa de microtitulação de fundo plano (dois poços, 24 horas, 37 ° C). P. aeruginosa e P. fluorescens são ambos organismos móveis e formam um biofilme na interface ar-líquido. S. aureus é não-móveis e forma um biofilme no fundo do poço.
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Discussion
Este método pode ser modificada para uso com uma grande variedade de espécies microbianas. Micróbios móveis tipicamente aderir às paredes e / ou fundo dos poços, enquanto os não-móveis micróbios normalmente aderir ao fundo dos poços. As condições ideais para a formação de biofilme (ou seja, meio de crescimento, temperatura, tempo de incubação) deve ser determinado empiricamente para cada micróbio. Eu recomendo realizar múltiplas repetições para cada estirpe ou condição (4-8), e incluindo um controle positivo e, se possível, um controle negativo em cada placa.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Meus agradecimentos a Sherry Kuchma, Pete Newell e Shanks Robert para fornecer as imagens na Figura 1. Este trabalho foi financiado pelo NIH para conceder R01AI083256 GAO
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Casamino acids | BD Biosciences | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| Microtiter plates | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. |
| Microtiter plate lids | BD Biosciences | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
- Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
- Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
- Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
- Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
- Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
