Summary
Analysen beskriver ett snabbt sätt att mäta tidiga biofilm bildas i bakterier och svampar. Denna metod använder en mikrotiterplatta som substrat för mikrobiell biofilm bildning och biofilmen visualiseras med hjälp av stam kristallviolett. Analysen ger antingen en kvalitativ eller kvantitativ analys för tidigt biofilm bildas.
Abstract
Biofilmer är samhällen av mikrober knutna till ytor som kan hittas i medicin, industri och naturliga inställningar. I själva verket representerar livet i en biofilm förmodligen dominerar läge för tillväxt för mikrober i de flesta miljöer. Mogna biofilmer har några tydliga särdrag. Biofilm mikrober är oftast omgivna av en extracellulär matrix som ger struktur och skydd för samhället. Mikrober som växer i en biofilm har också en karakteristisk arkitektur i allmänhet består av macrocolonies (innehåller tusentals celler) omgiven av vätskefyllda kanaler. Biofilm odlade mikrober är också kända för sitt motstånd mot en rad av antimikrobiella medel inklusive kliniskt relevanta antibiotika.
Den mikroteststrips maträtt analys är ett viktigt verktyg för studiet av de tidiga skedena i biofilm bildning, och har tillämpats i första hand för studier av bakteriell biofilm, även om denna analys har också använts för att studera svamp biofilm bildas. Eftersom denna analys använder statiska, batch-tillväxt förhållanden tillåter det inte för bildandet av mogna biofilmer som vanligtvis förknippas med flödessystem cell. Däremot har analysen varit effektiv på att identifiera många faktorer som krävs för initiering av biofilm bildning (dvs flageller, pili, adhesinerna, enzymer involverade i cykliska-di-GMP bindande och ämnesomsättning) och liksom gener involverade i extracellulär polysackarid produktion. Vidare visar publicerade arbeten som biofilmer odlas i mikroteststrips rätter inte utveckla några egenskaper hos mogna biofilm, en sådan antibiotika tolerans och motstånd mot immunförsvaret effectors.
Denna enkla mikroteststrips maträtt analysen möjliggör bildandet av en biofilm på väggen och / eller botten av en mikrotiter maträtt. Den höga genomströmningen natur-analysen gör den användbar för genetisk skärmar, samt testning biofilm bildning av flera stammar under olika odlingsbetingelser. Varianter av denna analys har använts för att bedöma tidigt biofilm formation för en mängd olika mikrober, inklusive men inte begränsat till, pseudomonads, Vibrio cholerae, Escherichia coli, staphylocci, enterokocker, mykobakterier och svampar.
I protokollet beskrivs här, kommer vi att fokusera på användningen av denna analys för att studera biofilm bildning av modellen organismen Pseudomonas aeruginosa. I denna analys, är omfattningen av biofilm bildas mäts med hjälp av färgen kristallviolett (CV). Däremot har ett antal andra kolorimetriska och metabola fläckar rapporterats för kvantifiering av biofilm bildas med hjälp av analysen mikrotiterplattan. Den lätthet, låga kostnader och flexibilitet mikrotiterplatta analysen har gjort det ett viktigt verktyg för studier av biofilmer.
Protocol
1. Växande en biofilm
- Odla en kultur av vildtyp Pseudomonas aeruginosa eller mutant stam över natten i ett rikt medium (dvs LB)
- Späd över 1:100 natten kultur i färskt medium för biofilm analyser. En vanlig biofilm analyssubstratet för P. aeruginosa är M63 minimal mediet kompletteras med magnesiumsulfat, glukos och casamino syror (se tabell). Som ett alternativ biofilm-främjande medel som stimulerar mindre plankton tillväxt och en mer robust biofilm, glukos och casamino syror kan ersättas med arginin som enda kol och energikälla.
- Tillsätt 100 mikroliter av utspädning per brunn i en 96 bra maträtt. För kvantitativa analyser använder vi vanligtvis 4-8 replikera brunnar för varje behandling.
- Inkubera mikrotiterplatta för 4-24 timmar vid 37 ° C.
2. Färgning av biofilm
- Efter inkubation, dumpa ut celler genom att vrida plattan över och skaka ur vätskan.
- Försiktigt dränka plattan i en liten balja med vatten (dvs använda bottnar pipettspetsen boxar för P1000 pipetmen som badkar). Skaka ut vatten. Upprepa denna procedur en andra gång. Detta steg bidrar till att avlägsna lös celler och media komponenter som kan färgas i nästa steg, och avsevärt sänker bakgrundsfärgning.
- Tillsätt 125 mikroliter av en 0,1% lösning av kristallviolett i vatten i varje brunn på mikrotiterplattan. Använd handskar och en laboratorierock samtidigt som lösningen. Var försiktig när du väger in CV som pulvret hydroscopic och lätt fläckar kläder, hud etc.
- Inkubera mikrotiterplattan i rumstemperatur i 10-15 min.
- Skölj plattan 3-4 gånger med vatten genom att sänka ned i en balja med vatten enligt ovan, skaka ut och blot kraftfullt på en bunt pappershanddukar att befria tallrik allt överflödigt celler och färgämne.
- Vänd mikrotiterplatta upp och ner och torka några timmar eller över natten.
- För kvalitativa analyser kan brunnarna bli fotograferad när den torkat.
3. Kvantifiera Biofilm
- Tillsätt 125 mikroliter av 30% ättiksyra i vatten till varje brunn på mikrotiterplattan att löses CV.
- Inkubera mikrotiterplattan i rumstemperatur i 10-15 min.
- Överföring 125 mikroliter av solubilized CV till en ny flatbottnade mikrotiter maträtt.
- Kvantifiera absorbansen i ett plattläsaren vid 550 nm med 30% ättiksyra i vatten, som tom.
4. Representativa resultat:
Figur 1. Visar ett representativt resultat för analyser biofilm bildning utförts för Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens och Staphylococcus aureus. (A) från sidan av brunnen med en biofilm av P. aeruginosa (8 timmar, 37 ° C). (B) A-sidan grund av den väl med en biofilm av P. fluorescens (6 timmar, 30 ° C). (C) En top-down bild av biofilm som bildas av S. aureus i en flat botten mikrotiterplatta (två brunnar, 24 timmar, 37 ° C). P. aeruginosa och P. fluorescens är både rörliga organismer och bildar en biofilm på luft-vätske-gränssnitt. S. aureus är icke-rörliga och bildar en biofilm på botten av brunnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna metod kan modifieras för att användas med en mängd olika mikroorganismer. Rörliga mikrober följer vanligtvis på väggarna och / eller botten av brunnarna, medan icke-rörliga mikrober vanligtvis hålla sig till botten av brunnarna. Den optimala förutsättningar för biofilm bildning (dvs tillväxt medium, temperatur, tid för inkubation) skall bestämmas empiriskt för varje mikrob. Jag rekommenderar utföra flera replikat för varje stam eller villkor (4-8), och med en positiv kontroll, och om möjligt, en negativ kontroll på varje platta.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Tack till Sherry Kutjma, Pete Newell och Robert Shanks för att ge bilderna i figur 1. Detta arbete stöddes av NIH bidrag R01AI083256 till Gao
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 X M63 | Prepare as a 5X M63 stock by dissolving 15g KH2PO4, 35g K2HPO4 and 10g (NH4)2SO4 in 1 L of water. This stock d–s not need to be autoclaved and can be stored at room temperature. Dilute 5X stock 1:5, autoclave, cool, then add the desired components. | ||
| KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | |
| K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A5132 | |
| Magnesium sulfate | Fisher Scientific | M63-500 | Add to 1 mM final concentration. Prepare as a 1 M stock in water and autoclave. |
| Glucose | Fisher Scientific | D16-3 | Add to 0.2% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Casamino acids | BD Biosciences | 223050 | Add to 0.5% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and autoclave. |
| Arginine | Sigma-Aldrich | A5131 | Add to 0.4% final concentration. Prepare as a 20% stock in water and filter sterilize. This alternative carbon/energy source can replace glucose and casamino acids |
| Microtiter plates | BD Biosciences | 353911 | Falcon 3911, Microtest III, Flexible assay plates, 96 well, U-bottom, non-sterile, non-tissue-culture treated. |
| Microtiter plate lids | BD Biosciences | 353913 | The lids can be reused by cleaning with 95% ethanol in water. |
| Crystal violet | Sigma-Aldrich | 229641000 | Prepare as a 0.1% solution in water. |
References
- O'Toole, G. A., Kolter, R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol. Microbiol. 28, 449-461 (1998).
- O'Toole, G. A. Methods in Enzymology. Doyle, R. J. , Academic Press. San Diego, CA. 91-109 (1999).
- Mah, T. F. A genetic basis for Pseudomonas aeruginosa biofilm antibiotic resistance. Nature. 426, 306-310 (2003).
- Kuchma, S. L., Connolly, J. P., O'Toole, G. A. A three-component regulatory system regulates biofilm maturation and type III secretion in Pseudomonas aeruginosa. J Bacteriol. 187, 1441-1454 (2005).
- Caiazza, N. C., O'Toole, G. A. SadB is required for the transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas aeruginosa PA14. J Bacteriol. 186, 4476-4485 (2004).
- Shanks, R. M., Sargent, J. L., Martinez, R. M., Graber, M. L., O'Toole, G. A. Catheter lock solutions influence staphylococcal biofilm formation on abiotic surfaces. Nephrol Dial Transplant. 21, 2247-2255 (2006).
- Caiazza, N. C., Merritt, J. H., Brothers, K. M., O'Toole, G. A. Inverse regulation of biofilm formation and swarming motility by Pseudomonas aeruginosa PA14. J. Bacteriol. 189, 3603-3612 (2007).
- Hinsa, S. M., Espinosa-Urgel, M., Ramos, J. L., O'Toole, G. A. Transition from reversible to irreversible attachment during biofilm formation by Pseudomonas fluorescens WCS365 requires an ABC transporter and a large secreted protein. Mol Microbiol. 49, 905-918 (2003).
- Mack, D. Characterization of transposon mutants of biofilm-producing Staphylococcus epidermidis impaired in the accumulative phase of biofilm production: genetic identification of a hexosamine-containing polysaccharide intracellular adhesin. Infect. Immun. 62, 3244-3253 (1994).
- Vidal, O. Isolation of an Escherichia coli K-12 mutant strain able to form biofilms on inert surfaces: involvement of a new ompR allele that increases curli expression. J. Bacteriol. 180, 2442-2449 (1998).
- Junker, L. M., Clardy, J. High-throughput screens for small-molecule inhibitors of Pseudomonas aeruginosa biofilm development. Antimicrob Agents Chemother. 51, 3582-3590 (2007).
