Summary
זיהוי המנגנונים נזק לשרירים הוא קריטי. כאן אנו מציגים את הטכניקה היסטולוגית להכנת פרפין משובצים ו קפוא קטעי תסיסנית שרירי החזה. זה מאפשר ניתוח של מורפולוגיה שרירים לוקליזציה של חלבונים אחרים בתא השריר המרכיבים.
Abstract
אפיון מולקולארי של dystrophies ו myopathies שרירים בבני אדם חשף את המורכבות של מחלת שרירים ניתוח גנטי של מפרט שרירים, היווצרות ותפקוד במערכות מודל סיפקה תובנה חשובה הפיזיולוגיה השריר. לכן, זיהוי ואפיון המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס נזק לשרירים הוא קריטי. המבנה של מבוגר תסיסנית מרובת סיבים דומים השרירים השרירים מפוספס חוליות 1 ו נהילות הגנטי של תסיסנית עשה את זה מערכת גדולה לנתח מורפולוגיה שריר dystrophic ולאפיין את התהליכים המשפיעים על תפקוד השרירים הבוגרים הזדקנות זבובים 2. כאן אנו מציגים את הטכניקה היסטולוגית להכנת פרפין משובצים ו קפוא קטעי תסיסנית שרירי החזה. הכנות אלו מאפשרות הרקמה להיות מוכתם בכתמי היסטולוגית קלאסית שכותרתו עם צבעים חלבון גילוי, ובמיוחד cryosections הם אידיאליים עבור זיהוי immunohistochemical של חלבונים בשרירים ללא פגע. זה מאפשר ניתוח של מבנה רקמת השריר, זיהוי פגמים מורפולוגיים, זיהוי של דפוס הביטוי של שריר / עצב ספציפי חלבונים בשרירים תסיסנית מבוגר. טכניקות אלה יכולים גם להיות שונה במקצת עבור חתך של חלקי גוף אחרים.
Protocol
1. הכנה
- להכין טרי מקבע של Carnoy על ידי שילוב של אתנול אבסולוטי, כלורופורם וחומצה אצטית קרחונית ביחס 6:03:01 בהתאמה. 3 זו, כמו גם את כל פתרונות הצללה קולרים יש לשמור בצנצנות זכוכית מכתים (ראה סעיף ריאגנטים המלצה).
- הכן את רדיד אלומיניום כיסים את הגודל הנכון עבור הקולרים.
- הכן את הפתרונות הבאים מכתים צנצנות: 2 X אתנול 40%, אתנול 70%, אתנול 2 X 100%, methylbenzoate (MB), 50/50 v / v מגה פרפין, 2 X פרפין. מניחים את MB מיכלי פרפין בערכת באינקובטור עד 60-65 ° C.
- פרפין חם לשפוך לתוך הכיסים כדי לסכל 60-65 ° C.
2. תיקון זבובים קולרים
- צרף את 4 צווארון תחת המשקפת באמצעות קלטת במצב אנכי שבו אתה יכול לראות את נקודת הכניסה עבור לטוס.
- הרדימי זבובים באמצעות פחמן דו חמצני או באמצעות היפותרמיה באמצעות בלוק קרח. היזהרו לא להקפיא את הזבובים.
- בעזרת מלקחיים, להרים זבובים בודדים על ידי גרירה כנפיהם מקום לתוך הצווארון מכוונת כראוי (הראש ואת בית החזה על גבי להבים הבטן מתחת הלהבים). 10-20 זבובים צריך להתאים בקלות לתוך הצווארון.
הערה: אם אתה מנתח מספר גנוטיפים, לא לשכוח לרשום את מספר צווארון גנוטיפ המקביל.
3. פרפין סעיפים של תסיסנית Thoraxes
- שינוי מיקום צווארון לפתרון של Carnoy ולתקן את הרקמה ב 4 ° C במשך הלילה.
- לאחר קיבוע, מייבשים את המדגם באמצעות ריכוז גדל והולך של אתנול. במשך 10 דקות כל אחד לצלול לתוך הצווארון 40% (פי 2), 70% ו 100% (2 פעמים) אתנול בטמפרטורת החדר. צווארון דגירה הבא בפתרון + מגה מגה פרפין (1:1) למשך 30 דקות בכל אחד ואז לחדור צווארון בשני שינויים של פרפין במשך 60 דקות כל אחד ב 60-65 ° C. במהירות להעביר את הקולר לכיס לסכל ולמלא עם נמס (60-65 ° C) פרפין. מקום זה בטמפרטורת החדר ולאפשר פרפין להפוך קשה (עדיף להשאיר לילה). שים לב כי הקולר אפשר לשים בכיס לסכל ב נטיות שונות, תלוי בכיוון של חלקים אתה צריך (אורכית או רוחבית).
- לגולל בלוקים פרפין יבש עם צווארונים מ לסכל את ובעדינות להפריד את הצווארון מהגוש פרפין. בעזרת סכין חדה או אזמל בזהירות לחתוך את פרפין חוץ מכל רחבי הרקמה לעוף.
- חותכים את גוש פרפין עם 7-10 סעיף צעדים מיקרומטר על microtome סיבוב ולאפשר את הרקמה לחתוך לצוף שטוח אמבטיה 37 מעלות צלזיוס המים. הנח את רקמת מחולק בשקופיות הקוטב לאפשר ייבוש במשך הלילה. שקופיות אלה יכולים לשמש מכתים עם hematoxyline ו eosin (איור 1A-D), toluidine כחול, אנילין כחול או מת אחר לדמיין מבנים רקמות, כמו גם מכתים נוגדן (איור 1E-E ``).
4. Cryosections של תסיסנית Thoraxes
- כמו בסעיפים פרפין, להכין את זבובים צווארון ואופנה כיס רדיד אלומיניום. מקרר מקפיא יהיה צורך להכין את דגימות. ודא כי המקרר הוא כ -60 ° C, להשתמש אתנול מעט קרח יבש, כדי לאפשר להגיע לטמפרטורה זו. שעה לפני תחילת הניסוי הניח את בקבוק בינוני הטבעה cryo (Tissue-Tek מתחם אוקטובר) במהופך מקרר 4 מעלות צלזיוס על מנת לקרר אותו למטה כדי לצמצם את היווצרות של בועות אוויר.
- שינוי מיקום צווארון זבובים לכיס לסכל כי כבר מראש מקורר במשך כמה דקות בתוך מקרר מקפיא במהירות למלא עם תרכובת cryo-הטבעת. תן להקפיא מדגם 3-10 דקות. לגולל בזהירות את הבלוק נוצר בתוך מקרר, בעדינות להפריד את הצווארון מהגוש הטבעה ושמתי אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך יום אחד לפחות.
- חותכים את השרירים קפואים על cryo-microtome בין -15 ו -18 ° C עם עובי חתך של 10-15 מיקרומטר. המקום בשקופיות מקוטב ולשמור על -20 ° C עד מוכן לעשות עיבוד נוסף. אנו מציעים לתקן את הרקמה בתמיסה 4% פורמלדהיד PBS עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר לפני צביעה נוגדן.
5. ליפידים איתור בשרירים תסיסנית
טיפות ליפידים ניתן להבחין בשמן אדום הו כתם על cryosections באמצעות פרוטוקול אימצה מן Sieber ו Thummel 5.
- לאחר קיבוע, לשטוף עם מים שקופיות פעמיים במשך 5 דקות, equilibrated ב פרופילן גליקול דקות 10 ו דגירה של כתם 3 שעות בשמן אדום O בטמפרטורת החדר. לאחר מכן לשטוף דגימות 2 דקות 5 פעמים ב פרופילן גליקול ו - 30 דקות ב-PBS. הר של גליצרול 30%.
6. נציג תוצאות:
תאנהיור 1. Parrafin-משובצים קטעים
Hematoxyline ו eosine מוכתם רוחבי (AB) ו אורכית (CD) של השרירים החלקים טיסה עקיף. A ו-C מראה שרירי מובנה נורמלי. חריגה על ידי השרירים גודל ומורפולוגיה מיוצגים על B ו-D בהתאמה (חיצים שחורים). סעיף רוחבי של מוכתם החזה תסיסנית עם הסמן, אנטי LamC המעטפה גרעיני DAPI, גרעיני כתם (EF). תצוגה מוגדלת של רגיל (חץ אדום) הידרדר (חץ צהוב) השרירים (F). G מייצג מקטע של מוכתם תסיסנית בדרכי העיכול עם LamC ו DAPI.
איור 2. חלקים קפואים
א רוחבי חלקים קפואים של בית החזה תסיסנית מוכתמים בשמן אדום O, טיפות תווית השומנים.
סעיפים ב קפוא אורך של השרירים טיסה ישירה מוכתם אנטי DG, שריר sarcolemma סמן ואת DAPI.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
אנו מודים פרופ Eichele עבור ומאפשר לנו להשתמש cryo-microtome. העבודה מומנה על ידי מקס פלאנק, Gesselschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel collars | Home made | Specially constructed | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Aluminum foil | Any Supplier | ||
| Blade or scalpel | Any Supplier | ||
| Wheaton macro staining jar | Wheaton | 900200 | |
| Microtome | Carl Zeiss, Inc. | Model: Hyrax M25 | |
| Cryo-microtome | Leica Microsystems | Model CM3050S | |
| 60-65°C Incubator | Any Supplier | Large enough to hold at least 4 staining jars | |
| Freezing cooler with metal block | Any Supplier | Store at -80°C | |
| Super-frost slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9161155 | |
| Cover slips | Any Supplier | Recommend 24 X 40 mm | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Analytical grade |
| Glacial acetic acid | Merck & Co., Inc. | 100063 | Analytical grade |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 100983 | Analytical grade |
| Methylbenzoate | Sigma-Aldrich | M29908-500G | Analytical grade |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | 76258 | Paraffin |
| Tissue-Teck O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 16% formaldehyde, methanol free | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150-1L |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).
- Shcherbata, H. R. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy. The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).
- Kucherenko, M. M. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex. PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. Carnoy fixation: practical and theoretical considerations. Histochemie. 16, 361-36 (1968).
- Ashburner, M. Drosophila - A Laboratory Manual. , CSHL Press. (1989).
- Sieber, M. H., Thummel, C. S. The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila. Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).
