Summary
تحديد الآليات الكامنة وراء تلف العضلات أمر بالغ الأهمية. هنا نقدم تقنية النسيجي لإعداد البارافين المجمد وجزءا لا يتجزأ من المقاطع للعضلات الصدر ذبابة الفاكهة. هذا يسمح تحليل مورفولوجيا العضلات وتوطين البروتين وغيرها من مكونات الخلية العضلية.
Abstract
التوصيف الجزيئي للضمور العضلات واعتلال العضلات في البشر قد كشف تعقيد مرض في العضلات والتحليل الجيني للمواصفات العضلات ، وقدمت وظيفة في تشكيل نموذج نظم معلومات قيمة حول فسيولوجيا العضلات. ولذلك ، وتحديد وتوصيف الآليات الجزيئية التي تكمن وراء تلف العضلات أمر بالغ الأهمية. بنية العضلات الكبار متعددة الألياف ذبابة الفاكهة تشبه العضلات المخططة الفقاريات (1) وقابلية الإستطراق الوراثي للذبابة الفاكهة جعلت من نظام رائع لتحليل التصنع مورفولوجيا العضلات وتوصيف العمليات التي تؤثر على وظيفة العضلات في البالغين المسنين الذباب 2. هنا نقدم تقنية النسيجي لإعداد البارافين المجمد وجزءا لا يتجزأ من المقاطع للعضلات الصدر ذبابة الفاكهة. تسمح هذه الاستعدادات للأنسجة أن تكون ملطخة البقع النسيجية الكلاسيكية والبروتين المسمى مع الأصباغ كشف ، وتحديدا cryosections مثالية للكشف المناعى من البروتينات في عضلات سليمة. وهذا يسمح لتحليل بنية النسيج العضلي ، وتحديد العيوب الشكلية ، والكشف عن نمط التعبير عن العضلات / عصبون محددة البروتينات في العضلات الكبار ذبابة الفاكهة. ويمكن أيضا أن تكون هذه التقنيات معدلة بشكل طفيف لsectioning من أجزاء أخرى من الجسم.
Protocol
1. إعداد
- تعد طازجة لتثبيتي Carnoy الايثانول من خلال الجمع بين المطلق والكلوروفورم وحمض الخليك الجليدية في نسبة 06:03:01 التوالي. 3 وهذا ، فضلا عن حلول لياقات غمر يجب أن تبقى في تلوين الزجاج الجرار (انظر القسم الكواشف للتوصية).
- تحضير رقائق الألومنيوم جيوب الحجم الصحيح للالياقات.
- إعداد الحلول التالية في تلطيخ الجرار : 2 X 40 ٪ إيثانول ، إيثانول 70 ٪ ، 2 X الإيثانول بنسبة 100 ٪ ، methylbenzoate (MB) ، 50/50 MB V / V والبارافين ، 2 X البارافين. ضع MB البارافين والحاويات في مجموعة حاضنة ل60-65 درجة مئوية.
- البارافين الدافئ لتصب في جيوب لاحباط 60-65 درجة مئوية.
2. الذباب في تحديد الياقات
- إرفاق 4 طوق تحت مجهر باستخدام الشريط في وضع عمودي حيث يمكنك ان ترى نقطة دخول للطيران.
- تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون أو انخفاض درجة حرارة الجسم عن طريق استخدام كتلة الجليد. يجب الحرص على عدم تجميد الذباب.
- باستخدام الملقط ، والتقاط الذباب الفردية عن طريق الاستيلاء على اجنحتها والمكان إلى طوق الموجهة بشكل صحيح (الرأس والصدر على رأس من ريش والبطن تحت ريش). وينبغي أن تناسب بسهولة 10-20 الذباب في الترقوة.
ملاحظة : إذا كنت تحليل المورثات عدة ، لا ننسى لتقديم مذكرة لعدد ذوي الياقات البيضاء وراثى المقابلة.
3. أقسام البارافين من الصدور ذبابة الفاكهة
- نقل ذوي الياقات البيضاء إلى الحل Carnoy وإصلاح الأنسجة عند 4 درجات مئوية خلال الليل.
- بعد التثبيت ، يذوى العينة باستخدام تركيزات متزايدة من الايثانول. لمدة 10 دقيقة كل غمر ذوي الياقات البيضاء في 40 ٪ (2 مرات) ، 70 ٪ و 100 ٪ (2 مرات) الايثانول في درجة حرارة الغرفة. احتضان ذوي الياقات المقبل في حل ميغابايت MB والبارافين + (1:1) لمدة 30 دقيقة في كل ثم اختراق طوق في تغييرين من البارافين لمدة 60 دقيقة في كل 60-65 درجة مئوية. الانتقال السريع لذوي الياقات البيضاء في جيب احباط وتمتلئ ذاب (60-65 درجة مئوية) البارافين. وضعه في درجة حرارة الغرفة والسماح للالبارافين ليصبح الثابت (فمن الأفضل أن تترك بين عشية وضحاها). لاحظ أنه يمكن أن توضع في الجيب طوق احباط في توجهات مختلفة ، اعتمادا على اتجاه المقاطع التي تحتاج إليها (الطولية أو العرضية).
- بسط كتل البارافين الجافة بأطواق من احباط ومنفصلة بلطف طوق من كتلة البارافين. مع مساعدة من شفرة حادة أو مشرط قطع بعناية من البارافين من خارج النسيج من مختلف أنحاء الطيران.
- خفض كتلة البارافين مع الخطوات 7-10 ميكرون الباب على مشراح التناوب والسماح بتعويم قطع الأنسجة شقة في حمام المياه 37 درجة مئوية. مكان النسيج مقطوع على شرائح والسماح للتجفيف القطبية طوال الليل. ويمكن استخدام هذه الشرائح لتلطيخ مع hematoxyline ويوزين (الشكل 1A - D) ، طولويدين زرقاء ، الأزرق الأنيلين أو وفاة أخرى لتصور هياكل الأنسجة ، فضلا عن تلطيخ الأضداد (الشكل 1E - E ``).
4. Cryosections الصدور من ذبابة الفاكهة
- كما هو الحال مع أقسام البارافين ، وإعداد الذباب في الترقوة والأزياء جيب رقائق الألومنيوم. ستكون هناك حاجة إلى تجميد برودة لتحضير العينات. تأكد من أن حوالي برودة -60 درجة مئوية ، واستخدام الايثانول قليلا والثلج الجاف للسماح للوصول إلى هذه الدرجة. وضع قبل ساعة من بدء التجربة زجاجة من البرد المتوسطة تضمين - (الأنسجة تيك مجمع أكتوبر) رأسا على عقب في البراد 4 درجات مئوية وذلك لتبريده والتقليل من تشكيل فقاعات الهواء.
- نقل ذوي الياقات البيضاء مع الذباب إلى جيب احباط الذي تم قبل عدة دقائق لتبرد داخل برودة تجميد وتعبئة بسرعة مع مجمع البرد التضمين. السماح لعينة من أجل تجميد 30-10 دقيقة. بسط بعناية تشكيل كتلة داخل برودة ، منفصلة بلطف طوق من كتلة التضمين ووضعها في -20 درجة مئوية لمدة يوم واحد على الأقل.
- قطع العضلات المجمدة على البرد مشراح بين -15 و -18 درجة مئوية مع سمك مقطع من 10-15 ميكرون. مكان على الشرائح الاستقطاب والحفاظ على -20 درجة مئوية حتى على استعداد للقيام مزيد من المعالجة. نقترح إصلاح الأنسجة في 4 ٪ الفورمالديهايد PBS حل لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تلوين الأجسام المضادة.
5. الكشف عن الدهون في العضلات ذبابة الفاكهة
ويمكن الكشف عن قطيرات الدهن بزيت أحمر يا وصمة عار على cryosections باستخدام البروتوكول المعتمد من سيبر وThummel 5.
- بعد التثبيت ، وتغسل الشرائح بالماء مرتين لمدة 5 دقائق ، معايرتها في بروبيلين غليكول لمدة 10 دقيقة وصمة عار لاحتضان ح النفط في الحمراء O 3 في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل عينات 2 مرات لمدة 5 دقائق في غليكول البروبيلين و 30 دقيقة في برنامج تلفزيوني. جبل في الجلسرين 30 ٪.
6. ممثل النتائج :
تينلدى عودتهم 1. Parrafin جزءا لا يتجزأ من المقاطع
وHematoxyline eosine عرضية الملون (AB) والطولية (CD) أجزاء من عضلات الطيران غير المباشرة. A و C منظم معارض العضلات العادية. يتم تمثيل غير طبيعي من قبل العضلات وحجم التشكل على B و D على التوالي (الأسهم السوداء). القسم الملون من عرضية الصدر مع مكافحة ذبابة الفاكهة LamC ، علامة مغلف النووية ودابي النووية وصمة عار (EF). عرض موسع العادية (السهم الأحمر) وتدهورت (السهم الأصفر) العضلات (F). G يمثل الجزء الملون من ذبابة الفاكهة الأمعاء مع LamC ودابي.
الشكل 2. أقسام المجمدة
ألف المقاطع العرضية المجمدة للالملون الصدر مع ذبابة الفاكهة الحمراء النفط O ، قطرات الدهون التسمية.
المقاطع الطولية باء المجمدة للعضلات الطيران غير المباشرة ملطخة المديرية العامة لمكافحة والعضلات علامة غمد الليف العضلي ودابي.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نشكر الأستاذ Eichele على السماح لنا استخدام مشراح البرد. وقد تم تمويل العمل ماكس بلانك Gesselschaft.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stainless steel collars | Home made | Specially constructed | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-10 | |
| Aluminum foil | Any Supplier | ||
| Blade or scalpel | Any Supplier | ||
| Wheaton macro staining jar | Wheaton | 900200 | |
| Microtome | Carl Zeiss, Inc. | Model: Hyrax M25 | |
| Cryo-microtome | Leica Microsystems | Model CM3050S | |
| 60-65°C Incubator | Any Supplier | Large enough to hold at least 4 staining jars | |
| Freezing cooler with metal block | Any Supplier | Store at -80°C | |
| Super-frost slides | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 9161155 | |
| Cover slips | Any Supplier | Recommend 24 X 40 mm | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306 | Analytical grade |
| Glacial acetic acid | Merck & Co., Inc. | 100063 | Analytical grade |
| Ethanol | Merck & Co., Inc. | 100983 | Analytical grade |
| Methylbenzoate | Sigma-Aldrich | M29908-500G | Analytical grade |
| Paraplast plus | Sigma-Aldrich | 76258 | Paraffin |
| Tissue-Teck O.C.T. compound | Sakura Finetek | 4583 | |
| 16% formaldehyde, methanol free | Polysciences, Inc. | 18814 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5150-1L |
References
- Miller, A. The internal anatomy and histology of the imago of Drosophila melanogaster. , CSHL Press. Cold Spring Harbor. (1950).
- Shcherbata, H. R. Dissecting muscle and neuronal disorders in a Drosophila model of muscular dystrophy. The EMBO journal. 26, 481-481 (2007).
- Kucherenko, M. M. Genetic modifier screens reveal new components that interact with the Drosophila dystroglycan-dystrophin complex. PloS one. 3, e2418-e2418 (2008).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S., Conner, H. M., Terry, M. S. Carnoy fixation: practical and theoretical considerations. Histochemie. 16, 361-36 (1968).
- Ashburner, M. Drosophila - A Laboratory Manual. , CSHL Press. (1989).
- Sieber, M. H., Thummel, C. S. The DHR96 nuclear receptor controls triacylglycerol homeostasis in Drosophila. Cell metabolism. 10, 481-481 (2009).
