Summary
Abstract
Мы демонстрируем основные методы пресинаптических записи зажим патч на чашечке Хелд, млекопитающих центральной нервной терминал нервную систему. Электрические записи из пресинаптических терминала позволяют измерений потенциалов действия, течений кальциевых каналов, пузырьки синтеза (экзоцитоз) и последующего поглощения мембраны (эндоцитоза). Слияние везикулы нейротрансмиттера содержащие причины пузырьков мембраны, которые будут добавлены к клеточной мембране из чашечки. Это увеличение в размере клеточной мембраны измеряется как увеличение емкости. Последующим снижением емкости указывает эндоцитоза, процесс поглощения мембраны или отстранения от мембраны чашечки. Эндоцитоз, это необходимо для поддержания структуры чашечки, и это также необходимо для формирования пузырьков, которые будут заполняться с нейромедиатором для будущих событий экзоцитоза. Емкость записи на чашечке удерживаемые дали возможность прямо и быстро измерять везикулярного выпуска и последующего эндоцитоза в млекопитающих терминал нервов ЦНС. Кроме того, соответствующие постсинаптической активности может быть одновременно измеряется с помощью парных записей. Таким образом полную картину пресинаптические и постсинаптические электрической активности в центральной нервной системе синапса может быть достигнуто с помощью этого препарата. Здесь методы ломтик подготовки, морфологические признаки для идентификации чашечки из Хелд, основной патч зажимной техники, а также примеры емкости записи для измерения экзоцитоз и эндоцитоз представлены.
Protocol
Установка патча Зажим:
Оптика: оптика, очень важно найти хорошие клетки, а также установить положение о нем.
Постарайтесь, чтобы получить четкое изображение клеток: острые края, мягкий вид клеток.
Сканирование всей области, чтобы искать хорошего MNTB основной клетки с прикрепленными чашечки. Повернуть блюдо искать чашечек с разных ракурсов. Сначала все в порядке, на практике на воздушном шаре формы терминала.
Выберите ячейки на поверхности среза, или в два слоя клеток-й. Целевая первые 1 / 3 от ячейки с пипеткой
Определение чашечки: Ищите двойной мембраной (см. рисунок 1) и поверните ломтик блюдо, чтобы увидеть его с разных точек зрения, чтобы помочь подтвердить, что это чашечки.
Рисунок 1
Глубина чашечки: Чашечка должна быть на поверхности или как можно ближе к поверхности, как это возможно.
Поверхность для исправления: использование тонкой фокусировки ручку на микроскопом, чтобы определить, как "широкий / глубокий" чашечки. Например, ~ 10% от полного включения точной фокусировки даст вам больше чем достаточно, площадь поверхности, чтобы исправить на.
Уплотнение на пресинаптических ячейки: Чтобы добраться до ячейки прилагается, обратите внимание на "маленьких" деформации на поверхности клетки, из-за давления поз (~ 0.15psi) в пипетку, использовать манипулятор для запуска пипетку вверх, вниз и поперек, и даже в поверхности терминала presyn, чтобы получить хороший деформации, а затем отпустите давление и применять всасывания, если и по мере необходимости.
PULSE, сбор данных программы:
Необходимо увеличить размер буфера перед первым использованием, а в случае необходимости путем отбора проб мощности.
Необходимо изменение нагрузки макросы каждый раз.
Жидкие Junction Потенциал: Presyn Решение Запись-11mV (отрицательный 11mV).
Presyn: Cslow = ~ 15 пФ
РТС макет для presyn: 10 мкс, 65% (более компенсация может возможно ж / из колебаний)
Перед записью емкостью: Тест релаксации тока (10 мВ, 10 мс прыжок), есть ли релаксации monoexponential, то есть, независимо от того presyn срок может быть смоделирована с одного отсека.
Фильтры: Установить на 30 кГц и 10 кГц (фильтр Бесселя 1 и 2 соответственно) в процессе релаксации измерения, чтобы убедиться, что быстрая компонента не упустил.
Во время мини-записей, Синьшэн использовали 10 кГц и 5 кГц. LGW попросил меня, чтобы использовать только один фильтр установлен на уровне 30 кГц, чтобы убедиться, мы можем измерить время нарастания мини.
Файлы именования: 7 цифр 000mmxx, где мм в месяц (или месяц и год) и хх числа клеток.
Очистка Решение линий: Линии очищается в конце эксперимента с 20 мл 0,1 М HCl затем по 200 мл ddH2O.
Внешние системы переработаны, насос скорость 20-30 оборотов в минуту.
(Раствор возвращения из ванны камеры потоки обратно в мерный цилиндр).
Настройка 3 отходящих линий для обеспечения достаточного всасывания.
Внесите пресинаптических Решение записи: ~ 310 милли осмолярный
Presyn Решение должно быть ~ 310 мОсм, чтобы предотвратить R-доступа увеличивается во время эксперимента.
Presyn пипетки решение отличается от postsyn пипетки раствор (Presyn имеет АТФ и ГТФ напр.).
ТТХ-TEA Решение (изолировать Са токи):
- Попробуйте применить после уплотнения, или даже изменение кода, на клетки, как чай в растворе блоков К-каналов и деполяризации клетки. Это не хорошо для клетки. По той же причине, она не может быть возможным повторное использование ломтик после TTX применяется.
- Сравните первый и последний ответ клетки, или ломтик, чтобы проверить наличие эффекта длительной деполяризации.
- ТТХ используется на 1 мкм вместо 0,5 мкМ поэтому эффект быстрее. Вам нужно ждать меньше времени после изменения решения.
Резка Ломтики
Vibratome настройки:
- 70 Гц поперечных колебаний
- Амплитуда: 1,0 мм
- Скорость движения вперед 0,01-0,02 мм / сек во время резки ломтиками с чашечки, 0,1 противном случае толщина 180 мкм (~ 150мкм в старых животных)
Ломтики инкубировать при температуре 37 ° С в течение 1 часа (в том числе сокращая время), то есть оставить в ванне 15-20 минут после резки.
Пипетки:
Presyn: 3,5-4,5 МОм во-первых, 3,0-3,5 МОм, когда чувствуют себя более уверенно
Использование ручной съемник для установки настроек. Использование задержки функция, поскольку стекло толстая (задержки в 200 или 1 работа)
Тип стекла: боросиликатное, стандартные стены, нет нити
Внешний диаметр: 2,0 мм
Внутренний диаметр 1,16 мм
Длина: 7,5 см
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
