Summary
Abstract
Vi visar de grundläggande teknikerna för presynaptiska patch clamp inspelningen vid blomfoder av Held, ett däggdjur centrala nervsystemet nervändsluten. Elektriska inspelningar från presynaptiska terminalen möjliggöra mätningen av aktionspotentialer, kalcium strömmar kanal vesikelfusion (exocytos) och senare membran upptag (endocytos). Sammansmältningen av blåsor som innehåller signalsubstansen gör att vesikler membran som ska läggas till cellmembranet på blomfoder. Denna ökning av mängden cellmembranet mäts som en ökning i kapacitans. Den efterföljande minskning av kapacitansen indikerar endocytos, processen för membran upptag eller avskiljande från blomfoder membranet. Endocytos är nödvändigt för att upprätthålla struktur blomfoder och det är också nödvändigt att bilda blåsor som kommer att fyllas med signalsubstansen för framtida exocytos händelser. Kapacitans inspelningar på blomfoder av Held har gjort det möjligt att direkt och snabbt mäta vesikulär release och därefter endocytos i ett däggdjurs CNS nervändsluten. Dessutom kan motsvarande postsynaptiska aktiviteten mätas samtidigt med hjälp av parade inspelningar. Alltså en fullständig bild av presynaptiska och postsynaptiska elektriska aktiviteten i en centrala nervsystemet synapsen är möjligt med hjälp av denna beredning. Här är metoderna för bit beredning, morfologiska egenskaper för identifiering av calyces av Held, grundläggande patch fastspänning tekniker, och exempel på kapacitans inspelningar för att mäta exocytos och endocytos presenteras.
Protocol
Patch Clamp Setup:
Optik: Optiken är mycket viktigt att hitta en bra cell, och att fastställa positionen för det.
Försök att få en tydlig bild av celler: skarpa kanter, mjuk utseende cell.
Skanna hela fältet för att leta efter bra MNTB viktigaste celler med bifogade blomfoder. Rotera skålen för att leta efter calyces från olika vinklar. Till en början är det OK att träna på ballong-formade terminalen.
Välj cell vid ytan av del eller i 2: a cellager. Mål den första 1 / 3: e av cell med pipett
Identifiera kalkarna: Leta efter en dubbel membran (se figur 1) och vrid slice maträtt att se den från olika vinklar för att bekräfta att det är ett blomfoder.
Figur 1
Djup av blomfoder: Calyx ska vara på ytan eller så nära ytan som möjligt.
Yta för patchning: Använd fin-fokus ratten på mikroskop för att avgöra hur "bred / djup" på blomfoder är. Till exempel kommer ~ 10% av ett helt varv på den fina fokus ge dig mer än tillräckligt med yta för att plåster på.
Tätning på en presynaptiska cellen: För att få till cell bifogas, leta efter en "liten" deformation på cellytan på grund av POS tryck (~ 0.15psi) i pipetten, använd manipulator att köra pipett upp, ner och över, och även i ytan av presyn terminalen att få en bra deformation, släpp sedan trycket och tillämpa sug, om det behövs och.
PULS, datainsamling programmet:
Behov av att öka buffertstorleken före första användningen, och när det behövs genom provtagning kapacitet.
Behöver du ladda modifierad makron varje gång.
Flytande Junction Potentiella: Presyn Inspelning Solution är-11mV (negativ 11mV).
Presyn: Cslow = ~ 15 pF
Rs comp för presyn: 10 μsec, 65% (mer ersättning får möjlighet w / ut svängningar)
Innan inspelningen kapacitans: Testström avslappning (10 mV, 10 msek hoppa) för att se om avslappning är monoexponentiellt, dvs om presyn sikt kan modelleras med samma utrymme.
Filter: Ställ vid 30 kHz och 10 kHz (Bessel filter 1 och 2) under avslappning mätning för att se en snabb komponent inte gått miste om.
Under mini-inspelningar, som används Xinsheng 10 kHz och 5 kHz. LGW bad mig att endast använda filter 1 inställd på 30 kHz till att vi kan mäta stiga-tiden för mini.
Filer namngivning: 7 siffror 000mmxx, där mm är månaden (eller månad och år) och xx är mobilnummer.
Rengöringslösning Linjer: Linjer rengöras vid slutet av försöket med 20 ml 0,1 M HCl följt av 200 ml ddH2O.
Externa lösningar återvinns, är pumpens varvtal 20-30 rpm.
(Lösning tillbaka från badet kammaren strömmar tillbaka in i mätglas).
Sätt upp tre utgående linjer för att säkerställa tillräcklig sugning.
Pipettera Presynaptiska Inspelning Lösning: ~ 310 millimeter Osmolar
Presyn lösningar måste vara ~ 310 mOsm att förhindra R-åtkomst öka under experimentet.
Presyn pipetten lösning skiljer sig från postsyn pipett lösning (Presyn har ATP och GTP ex.).
TTX-TEA Solution (för att isolera Ca strömmar):
- Försök att gälla efter plombering, eller till och med lapp, på cellen, som te i lösning block K-kanaler och depolarizes cellen. Detta är inte bra för cellen. Av samma anledning kan det inte vara möjligt att återanvända segmentet efter TTX tillämpas.
- Jämför den första och sista svar i cellen, eller slice för att leta efter effekter av långvarig depolarisation.
- TTX används vid 1 mikroM istället för 0,5 mikroM så effekten är snabbare. Måste vänta kortare tid efter byte lösningar.
Skärning Skivor
Vibratome inställningar:
- 70Hz laterala vibrationer
- Amplitud: 1,0 mm
- Hastighet framåt 0,01-0,02 mm / sek samtidigt som man skär skivor med blomfoder, 0,1 annars tjocklek: 180 ìm (~ 150nm i äldre djur)
Slices inkubera vid 37 ° C under 1 timme (inkluderar skära tid), dvs låt i badet 15-20 minuter efter kapning.
Pipetter:
Presyn: 3,5-4,5 Mohm i början, från 3,0 till 3,5 Mohm då känner sig tryggare
Använd avdragaren manual för att ställa in inställningar. Använd dröjsmål funktion eftersom glaset är tjockt (förseningar på 200 eller 1 arbete)
Glas typ: Borosilicate, standard väggen, ingen glödtråd
Ytterdiameter: 2,0 mm
Innerdiameter 1,16 mm
Längd: 7,5 cm
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
